alterlab-nf-core-sarek

nf-core/sarek — FASTQ から VCF へのバリアントコーリング

生リードからバリアントを得るワークフローランナーのエントリーポイントです。 **Nextflow nf-core/sarek パイプライン（-r 3.10.0 に固定）**を実行し、 生殖細胞系列または体細胞系列のショートリード FASTQ に対して、アライメント、GATK4 による重複マーキングと 塩基品質値の再較正、SNV／indel コーリングを行います。その後、生成された VCF を スイート内のデータベースおよび解析スキルに渡して解釈します。

このスキルは、スイートの Python ライブラリを使うバイオインフォマティクススキルに対する コマンドライン／ワークフロー版です。生データから VCF を得る工程にはこちらを使い、 VCF が手元にある場合はライブラリスキル（alterlab-pysam、alterlab-tiledbvcf）を使ってください。

このスキルを使う場面

ユーザーが次のことを希望する場合に、このスキルを使ってください。

• FASTQ から VCF へ進み、全ゲノム（WGS）または全エクソーム （WES）のショートリードのバリアントをコールする。
• 生殖細胞系列の SNV／indel コーリングを実行する（正常サンプルが 1 つ以上）。
• 体細胞系列／腫瘍・正常ペアのコーリングを実行する（一致する腫瘍＋正常、または腫瘍のみ）。
• nf-core/sarekを指定して使う、または各ステップを手作業で記述せずに、再現可能な「GATK ベストプラクティスに沿ったアライメントから VCF まで」のパイプラインを実行する。
• 中間の --step から実行を再開する（BAM／CRAM がすでにあり、再較正またはバリアントコーリングのみが必要）。

対象外 — 関連するリクエストはこちらに案内してください

実際のリクエスト内容…	案内先
Python（pysam／htslib）で既存の VCF／BAM を解析／フィルタリング／読み込む	alterlab-pysam
大規模な複数サンプルのバリアントストア（TileDB-VCF 配列）を保存／クエリする	alterlab-tiledbvcf
コール済みバリアントの臨床的意義（病原性／良性）を調べる	alterlab-clinvar
コール済みバリアントの集団アレル頻度を調べる	alterlab-gnomad
体細胞変異カタログ／がんセンサスを検索する	alterlab-cosmic
DNA バリアントではなく、RNA-seq の転写産物／遺伝子定量（salmon／kallisto）を行う	alterlab-rnaseq-quant
16S／ITS アンプリコン／マイクロバイオーム FASTQ からフィーチャーテーブルを作成する	alterlab-qiime2-amplicon
配列の相同性／類似性検索（BLAST+、DIAMOND）を行う	alterlab-blast
空間トランスクリプトミクスの近傍／SVG 解析を行う	alterlab-squidpy-spatial
カウントデータから差次的発現統計を算出する	alterlab-pydeseq2

ワークフローエンジンがなく、Nextflow とコンテナをインストールできないユーザーに対しても、 対応を断らないでください — 手動の GATK4 手順（以下／ references/manual_gatk4.md）に切り替えてください。

正確性に関する最大の注意点：sarek のデフォルトコーラーは Strelka です

3.10.0 の使用方法ドキュメントによると、 --tools が設定されていない場合、sarek は前処理を実行した後、Strelka のみを実行します。 GATK HaplotypeCaller や DeepVariant がデフォルトで実行されるわけではありません。ユーザーの意図に合わせて、 必ず --tools を明示的に設定してください。

意図	指定内容
GATK4 のベストプラクティスに沿った生殖細胞系列解析	--tools haplotypecaller
生殖細胞系列で最高の F1（CNN）	--tools deepvariant
体細胞系列の腫瘍・正常ペア	--tools mutect2（多くの場合 mutect2,strelka）
コホート全体での生殖細胞系列の同時ジェノタイピング	--tools haplotypecaller --joint_germline
GPU で高速化した生殖細胞系列解析（NVIDIA GPU プロファイルが必要）	--tools parabricks_haplotypecaller

--tools が受け付ける値（3.10.0 のスキーマによる）は、deepvariant、freebayes、 haplotypecaller、parabricks_haplotypecaller、mutect2、lofreq、mpileup、 muse、strelka、sentieon_*、構造バリアントコーラー（manta、tiddit、 indexcov）、CNV／純度解析ツール（ascat、cnvkit、controlfreec）、QC （ngscheckmate、msisensorpro）、varlociraptor、およびアノテーションツール （snpeff、vep、snpsift、bcfann）です。コーラーの選択によって適合率／再現率は大きく変わります — nf-core のベンチマーク（Hanssen et al., 2024）については references/caller_accuracy.md を参照してください。

パイプライン（実行方法）

1. サンプルシートを作成する

sarek の入力は CSV です。--step mapping で必須の列は次のとおりです。 patient、sample、lane、fastq_1、fastq_2。任意の列は sex（XX/XY、 デフォルトは NA）と status（0 = 正常、1 = 腫瘍、デフォルトは 0）です。status によって、sarek はペアが体細胞変異の解析対象であることを認識します。

ヘルパーを使って FASTQ ディレクトリから有効なシートを生成します（R1/R2 をペアにし、 lane を設定し、計算リソースを消費する前にスキーマを検証します）。

uv run python skills/bioinformatics/alterlab-nf-core-sarek/scripts/make_samplesheet.py \
    --fastq-dir ./fastq --patient PATIENT_01 --sample TUMOR_01 \
    --status 1 --sex XY --out samplesheet.csv

実行前に、追加の行（例：対応する正常サンプルを --status 0 --append で追加）を加えてください。 すべての列、BAM/CRAM の再入力用の行、腫瘍・正常の例については references/samplesheet_schema.md を参照してください。

2. パイプラインを実行する（バージョン固定）

nextflow run nf-core/sarek -r 3.10.0 \
    -profile docker \
    --input samplesheet.csv \
    --outdir ./results \
    --genome GATK.GRCh38 \
    --tools haplotypecaller \
    --aligner bwa-mem2

• 必ず -r 3.10.0 を指定してください — バージョンを固定しない実行では、異なるパイプラインバージョンに変わる可能性があります。
• -profile は必須です。ローカル環境では docker、singularity、apptainer、conda のいずれかを指定してください（クラスターでは test や組織の設定などを追加します）。
• --genome GATK.GRCh38 を指定すると、iGenomes/GATK GRCh38 リファレンスと、同梱の BQSR 既知サイト（dbSNP、Mills/1000G indels）が自動的に選択されます。
• --aligner の選択肢：bwa-mem（デフォルト）、bwa-mem2、dragmap、sentieon-bwamem、parabricks（GPU）。
• WES/パネルの場合は、--wes と --intervals targets.bed の両方を指定してください。--intervals は変異コールを行う領域を制限し、--wes はツールをターゲットシーケンス向けの設定に切り替えます。--wes を指定せずにエクソームデータを実行しても正常に完了しますが、WGS 向けに調整されたしきい値が使われます。
• パイプラインの途中から再開するには、--step（デフォルトは mapping。続いて markduplicates、prepare_recalibration、recalibrate、variant_calling、annotate）と、Nextflow の -resume を使用します。

前処理には GATK のベストプラクティスが適用されます：アラインメント → MarkDuplicates → BaseRecalibrator/ApplyBQSR（BQSR）→ 変異コール。詳細とすべてのフラグについては references/usage_3.10.0.md を参照してください。

3. 出力 VCF を解釈する

各コーラーの VCF は results/variant_calling/<tool>/ に出力されます。その後：

• 解析／フィルタリングには alterlab-pysam を使用します。
• 大規模なデータ（複数サンプル）の保存／クエリには alterlab-tiledbvcf を使用します。
• 臨床的意義の注釈には alterlab-clinvar、集団頻度には alterlab-gnomad、体細胞変異カタログには alterlab-cosmic を使用します。

代替手段：手動で GATK4 を実行する（Nextflow なし）

Nextflow とコンテナを実行できない場合は、GATK4 のベストプラクティスに沿った同等の処理を手動で実行します：bwa-mem2 mem → gatk MarkDuplicates → gatk BaseRecalibrator + gatk ApplyBQSR（dbSNP + Mills/1000G の既知サイトを使用）→ gatk HaplotypeCaller -ERC GVCF → gatk GenotypeGVCFs。コマンド一式とリソースバンドルのパスについては references/manual_gatk4.md を参照してください。

報告前のセルフチェック

• --tools を明示的に設定していますか？ユーザーが本当に Strelka を希望している場合を除き、Strelka がデフォルトで選択されるままにしないでください。
• バージョン（-r 3.10.0）を固定し、-profile を選択していますか？また、Nextflow は >=25.10.4 ですか（バージョン 3.10.0 で必要です）？
• 体細胞変異の解析では、サンプルシートに同じ patient の status 1 の腫瘍と status 0 の正常サンプルが含まれていますか？
• WES/パネルの場合、--wes と --intervals <capture.bed> の両方を指定しましたか？
• 実行後、ここで変異の意味を再解釈するのではなく、VCF の解釈を適切な関連スキルに振り分けましたか？

参考資料

• references/usage_3.10.0.md — バージョン固定の実行コマンド、プロファイル、--step／--aligner の選択肢、--wes と --intervals の組み合わせ、BQSR 前処理。3.10.0 の使用方法ドキュメントをもとにしています。
• references/samplesheet_schema.md — CSV の全列の仕様、BAM/CRAM の再入力、腫瘍・正常の具体例。
• references/caller_accuracy.md — --tools の選択と nf-core ベンチマークの概要（Hanssen et al., 2024, NAR Genomics & Bioinformatics）。
• references/manual_gatk4.md — Nextflow を使わない場合の、GATK4 ベストプラクティスに沿った代替手順。

AlterLab Academic Skills スイートの一部です。