無細胞タンパク質合成（CFPS）
システム選択ガイド
| システム | 最適な用途 | 収量 | PTM | ジスルフィド結合 | コスト |
|---|
| E. coli 抽出液 | 迅速なプロトタイピング、原核生物タンパク質 | 高（100-400 μg/mL） | なし | 低い（還元環境） | 低 |
| E. coli PURE | 定義された条件、非天然アミノ酸 | 中（50-150 μg/mL） | なし | 制御可能 | 高 |
| コムギ胚芽 | 真核生物タンパク質、膜タンパク質 | 高（100-500 μg/mL） | 限定的 | 中程度 | 中 |
| ウサギ網状赤血球 | 哺乳類タンパク質、翻訳後修飾の研究 | 低（10-50 μg/mL） | 一部あり | 低い | 高 |
| 昆虫（Sf21） | 糖タンパク質、複雑なフォールディング | 中（50-100 μg/mL） | 糖鎖付加 | 良好 | 高 |
| HeLa/CHO | ネイティブな哺乳類タンパク質 | 低（10-50 μg/mL） | 哺乳類型の全修飾 | 良好 | 非常に高い |
CFPS トラブルシューティングマトリクス
| 問題 | 考えられる原因 | 設計上の対処法 | 試薬による対処法 |
|---|
| 発現しない | N 末端の希少コドン、RBS の不良 | 最初の 30 コドンをコドン最適化する | BL21-CodonPlus 抽出液を使用する |
| 収量が低い | 強い mRNA 二次構造、鋳型の問題 | 5' UTR を最適化する（ΔG > -5 kcal/mol） | Mg²⁺（10-18 mM）と ATP を増やす |
| 凝集 | 疎水性タンパク質、翻訳速度が速い | 可溶化タグ（MBP、SUMO）を付加する | 0.1% Tween-20、シャペロンを加える |
| 不活性なタンパク質 | ミスフォールディング、補因子の不足 | 翻訳を遅くする（希少コドンを使用！） | GroEL/ES、DnaK/J を加える |
| 短縮 | 希少コドンクラスター、mRNA の不安定性 | AGG/AGA/CUA クラスターを除去する | 希少 tRNA を補充する |
| 分解 | タンパク質分解 | N 末端を Met-Ala にする | プロテアーゼ阻害剤を加える |
CFPS 向けコドン最適化
E. coli CFPS で避けるコドン
| コドン | アミノ酸 | 問題 | tRNA 存在量 |
|---|
| AGG | Arg | 非常に希少、停滞を引き起こす | 0.2% |
| AGA | Arg | 非常に希少、停滞を引き起こす | 0.4% |
| CUA | Leu | 存在量が少ない | 0.4% |
| AUA | Ile | 希少 | 0.5% |
| CGA | Arg | 解読効率が低い | 0.6% |
| CCC | Pro | 一時停止を引き起こす場合がある | 0.5% |
| GGA | Gly | 中程度 | 1.1% |
設計ルール
- 最初の 30 コドン：最も重要です。高頻度コドンのみを使用します
- 希少コドンクラスター：10 nt 以内に希少コドンが 2 個以上並ばないようにします
- 希少コドンの割合：コード配列全体の 5% 未満に保ちます
- GC 含量：発現のバランスを保つため、40-60% を目標にします
- 連続配列を避ける：G または C が 6 残基を超えて連続しないようにします（二次構造の原因になります）
- 遅いコドンの戦略的配置：ドメイン間に希少コドンを配置します（フォールディングを助けます！）
希少コドンを使用する場合
- ドメイン境界（共翻訳フォールディングを可能にします）
- 複雑な構造要素の前
- タンパク質がミスフォールディングしやすい場合
mRNA 鋳型の設計
5' UTR の最適化
| 要素 | 最適な設計 | 影響 |
|---|
| RBS（SD 配列） | AGGAGG、開始位置から 7-9 nt | リボソーム結合 |
| 間隔 | SD と AUG の間を 7 nt にする | 翻訳開始 |
| 二次構造 | ΔG > -5 kcal/mol | アクセス性 |
| 上流の AUG | 避ける（誤った開始を引き起こす） | 短縮を減らす |
二次構造の目標値
| 領域 | 理想的な ΔG | 影響 |
|---|
| AUG の前後 -30～+30 | > -5 kcal/mol | 翻訳開始 |
| 5' UTR 全体 | > -10 kcal/mol | リボソームの結合 |
| RBS のアクセス性 | 非塩基対形成 | 重要 |
鋳型の形式
| 形式 | メリット | デメリット |
|---|
| プラスミド | 安定、高収量 | クローニングが必要 |
| 線状 PCR 産物 | 高速、クローニング不要 | 安定化が必要な場合がある |
| mRNA | 直接翻訳 | 不安定、高価 |
ジスルフィド結合の形成
システムの特性
| システム | ネイティブなジスルフィド結合への対応 | 必要な添加剤 |
|---|
| 標準的な大腸菌抽出液 | 不良（DTT が含まれる） | IAM、PDI、GSSG/GSH |
| 酸化型大腸菌抽出液 | 良好 | 事前に酸化したグルタチオン |
| コムギ胚芽 | 中程度 | DTT を減らし、PDI を添加 |
| PURE システム | 最小限 | 完全な酸化システム |
| 昆虫／哺乳類 | 良好 | ミクロソーム膜 |
酸化的フォールディングプロトコル（大腸菌抽出液）
1. Deplete DTT from extract (dialysis or treatment with IAM 5 mM)
2. Add oxidized/reduced glutathione: 4 mM GSSG, 1 mM GSH (4:1 ratio)
3. Add 10 μM PDI (protein disulfide isomerase)
4. Optional: Add 5 μM DsbC (disulfide isomerase)
5. Express at 25°C (not 37°C) for better folding
6. Incubation time: 4-6 hours
ジスルフィド結合に富むタンパク質のヒント
- コムギ胚芽または酸化型抽出液から始めます
- 精密に制御するには PURE システムを使用します
- PDI/DsbC の共発現を検討します
- 非還元 SDS-PAGE で確認します
配列からの発現予測
| 特徴 | 良好 | やや不良 | 不良 |
|---|
| レアコドン含有率 | <3% | 3-8% | >10% |
| 最初の 30 コドン中のレアコドン数 | 0 | 1-2 | >2 |
| GC 含量 | 45-55% | 35-45% または 55-65% | <30% または >70% |
| 5' UTR ΔG | > -3 kcal/mol | -3 to -8 | < -10 kcal/mol |
| 疎水性ストレッチ | 連続して 5 未満 | 5-7 | 連続して >8 |
| N 末端残基 | Met-Ala、Met-Ser、Met-Gly | Met-Val、Met-Thr | Met-Arg、Met-Lys |
| システイン対 | 対になっている（偶数個） | 混在 | 奇数個（遊離チオール） |
可溶性を高める戦略
融合タグ（有効性の高い順）
| タグ | サイズ | 可溶性向上効果 | 切断 | 備考 |
|---|
| MBP | 40 kDa | 非常に高い | TEV、Factor Xa | 総合的に最良 |
| SUMO | 11 kDa | とても高い | SUMO プロテアーゼ | 切断後にネイティブな N 末端 |
| NusA | 55 kDa | 非常に高い | - | サイズが大きい |
| Trx | 12 kDa | 高い | エンテロキナーゼ | ジスルフィドタンパク質向け |
| GST | 26 kDa | 中程度 | - | 二量体 |
| His₆ | 1 kDa | 最小限 | - | 主に精製用 |
可溶性を高めるバッファー添加剤
| 添加剤 | 濃度 | 作用機序 |
|---|
| トレハロース | 50-100 mM | ケミカルシャペロン |
| グリセロール | 5-10% | 疎水性凝集を抑制 |
| L-アルギニン | 50-100 mM | 凝集を抑制 |
| Tween-20 | 0.05-0.1% | 表面への吸着を防止 |
| プロリン | 50 mM | オスモライトによる安定化 |
シャペロンの添加
| シャペロンシステム | 対象となる問題 | 濃度 |
|---|
| GroEL/GroES | 一般的なフォールディング | 1-2 μM |
| DnaK/DnaJ/GrpE | 凝集しやすいタンパク質 | 各 1 μM |
| Trigger Factor | 新生ポリペプチド鎖 | 1-2 μM |
| ClpB | 凝集体の可溶化 | 0.5 μM |
温度の最適化
| 温度 | 用途 | トレードオフ |
|---|
| 37°C | 高速発現、安定なタンパク質 | 凝集リスクが高い |
| 30°C | バランス型（デフォルト） | 良好な妥協点 |
| 25°C | ジスルフィドタンパク質、複雑なフォールド | 低速だが、フォールディングが良好 |
| 18-20°C | 凝集しやすいタンパク質 | 大幅に低速だが、フォールディングは最良 |
| 16°C | 低温ショックタンパク質 | 非常に低速、用途が限定的 |
大腸菌抽出液の調製（重要な変数）
| 変数 | 影響 | 最適範囲 |
|---|
| 回収時の細胞密度 | リボソーム含量 | OD₆₀₀ 2.5-3.5 |
| 溶解方法 | 抽出液の活性 | 超音波処理、ビーズ破砕 |
| ランオフ反応 | 内在性 mRNA を除去 | 37°C で 20-80 分 |
| Mg²⁺濃度 | 翻訳の忠実度 | 10-18 mM |
| K⁺濃度 | 翻訳速度 | 150-200 mM |
| エネルギーシステム | 合成の持続 | ATP/GTP、クレアチンリン酸 |
PURE システムの詳細
利点
- 組成が明確（プロテアーゼ／ヌクレアーゼを含まない）
- 線状 DNA テンプレートを良好に使用できます
- 非天然アミノ酸を取り込めます
- バッチ間で再現性があります
制限事項
- シャペロンがありません（別途添加してください）
- 翻訳後修飾がありません
- 粗抽出液より収量が低くなります
- コストが高くなります
PUREを使用する場合
- 非天然アミノ酸の取り込み
- 翻訳機構の研究
- 「クリーン」なタンパク質が必要な場合
- プロテアーゼ感受性の標的
- 線状テンプレートの発現
よくあるアーティファクトと解決策
低分子量のバンド
原因：早期終結、タンパク質分解、内部開始
解決策：
- 希少コドンのクラスターを最適化する
- プロテアーゼ阻害剤を添加する
- 内部AUGコドンがないか確認する
- PUREシステムを使用する
高分子量のバンド
原因：終結不全、リードスルー、凝集
解決策：
- 強い終止コドン（UAAを推奨）を使用する
- テンプレートの3'末端を確認する
- 放出因子（RF1/RF2）を添加する
- タンパク質濃度を下げる
可溶性タンパク質が得られない
原因：合成中の凝集
解決策：
- 温度を下げる（25°C → 18°C）
- シャペロンを添加する
- 可溶化タグを使用する
- 翻訳速度を最適化する
参考文献
CFPSの概要
抽出液の調製
PUREシステム
コムギ胚芽
コドン最適化
ジスルフィド結合の形成
可溶化タグ
温度の影響
