mageck

MAGeCK プールスクリーン解析

使用する場面

このスキルは、既存のシーケンスリードを提供されたガイドライブラリに対してカウントしたり、すでにカウント済みのプールスクリーンを比較したりするために使用します。カウントマトリクス、QC、ガイドおよび遺伝子の結果、コントラストの来歴、そしてエンリッチメント/枯渇に関する短い解釈を提供します。このワークフローはスクリーンを解析するものであり、ガイドを設計したり、ヒットのみから遺伝子機能を推測したりするものではありません。

ランタイム

検証済みのソースインストールと外部ランタイムに関する注意事項は references/runtime.md にあります。解析の前に mageck --version と mageck test --help の両方を確認してください。同梱の Python ヘルパーは標準ライブラリのみを使用します。 MAGeCK 自体は NumPy、SciPy、および RRA バイナリも必要とします。PDF/R レポートはオプションであり、ヘルパーには必要ありません。

公式リリースディレクトリには、依然として 0.5.9.5 が最新の MAGeCK リリースとして掲載されています。アップストリームは現在、別個の MAGeCK2 プロジェクトにリンクしています。これらのコマンドとヘルパーは MAGeCK 0.5.9.5 を対象としており、互換性のある MAGeCK2 インストールを対象とするものではありません。これはサービス API や認証を伴わない、ローカルのコマンドラインワークフローです。

ワークフロー

1. ライブラリのバージョン、摂動モダリティ、サンプル名、選択方向、 生物学的レプリケート、ベースライン材料、時点、バッチを確定します。シーケンシングレーンは 独立した生物学的レプリケートとは分けて扱います。プラスミドベースラインと細胞の day-zero ベースラインでは 答える問いが異なります。明示的な処理/対照の対比を必須とします。ヘルパーは 未使用のサンプルをすべて対照群に暗黙的に割り当てることはありません。
2. ガイド ID、DNA 配列、遺伝子を含むヘッダーなし TSV ライブラリを検証します。ID と 配列は一意でなければなりません。ヘルパーは sgRNA、Gene で始まるカウントテーブルヘッダーを要求し、 それに続いて c1 のような一意で数値でないサンプル名を要求します。MAGeCK は数値の名前を 列インデックスまたはカウント値として解釈する可能性があります。解析前に名前を変更してください。ガイド/遺伝子 ID には 空白を含めてはなりません。ヘルパーは曖昧な配列、およびカウント/ライブラリ ID や遺伝子の不一致を拒否します。 意図的なマルチターゲットガイドは上流で明示的に解決してください。これらはヘルパーによる意図的な 制限です。ネイティブの MAGeCK は他の入力形式も受け付けます。
3. FASTQ については、リード構造と既知のガイド配列を検査して、トリミングと オリエンテーションを確定します。MAGeCK の count を使用し、生物学的サンプルごとにスペース区切りの引数を 1 つ指定します。 同一サンプルの技術的レプリケートである場合にのみ、レーンをカンマ結合してください。マッピングが不良な場合は、 未マッピングリードとカウントサマリーのエビデンスを保持します。ゼロカウントのガイドもライブラリ内に残ります。 QC を改善するためにそれを除外しないでください。
4. 統計的検定の前に QC を実行します。ライブラリの代表性、ガイドあたりのリード中央値、 ゼロ率、ジニ係数、条件内レプリケート相関を確認します。ヘルパーの 10% ゼロおよび 0.8 相関のフラグは 確認の促しであり、普遍的な許容しきい値ではありません。高い相関は系統的なアーティファクトと 共存する可能性があります。リード深度は実験的な細胞カバレッジではありません。ヘルパーは生カウントの母集団ジニ係数を 使用し、MAGeCK ネイティブのカウントサマリージニ係数は有限標本補正付きの log(count + 1) を使用します。 それらの値やしきい値を同じ統計量として比較しないでください。
5. スクリーンに基づいて正規化を選択します。中央値正規化はほとんどのガイドが 安定していることを前提とします。強い全体的シフトがある場合、提供された検証済みのネガティブコントロールガイドが --normalization control を支持する根拠となることがあります。これらはガイド ID であり、1 行に 1 つである必要があります。遺伝子リストは 代用できません。生物学的対照サンプルとネガティブコントロールガイドは異なる 役割を果たします。少なくとも 2 つの対照が存在する必要があり、対照遺伝子に割り当てられたすべてのガイドは 対照として指定されなければなりません。--control-guides を指定すると、中央値正規化であっても RRA 帰無分布が 変わります。それらの由来を記録し、カウント分布を確認してください。 MAGeCK 0.5.9.5 では、選択されたサンプルで中央値がゼロ、またはゼロのガイドが 45% を超える場合に、中央値正規化が トータルカウントスケーリングに切り替わります。コントロール正規化の場合は コントロールガイドのサブセットを評価します。レポートで適用された手法、サイズファクター、警告を確認してください。
6. 2 群比較には test を使用します。--paired は両方のリストが対応する 生物学的順序で同じ長さであることを要求します。長さが一致するだけではペアリングを確立しません。 ヘルパーは要求された FDR で両方向の遺伝子を報告し、完全なランキングを保持します。 多因子デザインについては、references/design.md を参照してください。バッチや タイムコースを、正当化されない 2 群検定にまとめないでください。
7. 上位遺伝子のガイド一致、該当する場合は必須遺伝子の再現性、 ネガティブコントロール、レプリケートの一貫性、ヌクレアーゼノックアウトスクリーンにおけるコピー数アーティファクトを検査します。 FDR とともに効果量を報告します。濃縮されたガイドは、選択に応じて耐性、 増殖優位性、またはサンプリングアーティファクトを示す可能性があります。枯渇は普遍的な必須性を 意味するとは限りません。レプリケートの欠如や低カウントのガイドは推論を弱めます。

コマンド

パスはインストールされたスキルディレクトリからの相対パスで実行します。入力パスと出力パスはユーザーの 解析ディレクトリを指します。ヘルパーは既存の結果ディレクトリの再利用を拒否します。

# Single-end guide reads; trim and orientation must match the user's library preparation.
mageck count -l library.tsv --fastq c1.fastq.gz c2.fastq.gz t1.fastq.gz t2.fastq.gz \
  --sample-label c1,c2,t1,t2 --trim-5 0 --norm-method none -n counts

python scripts/screen_analysis.py qc --counts counts.count.txt --library library.tsv \
  --control c1 c2 --treatment t1 t2 --output qc.json

python scripts/screen_analysis.py test --counts counts.count.txt --library library.tsv \
  --control c1 c2 --treatment t1 t2 --normalization median --fdr 0.05 --output result

FASTQ コマンド構造は、合成された 2 ガイドライブラリで検証しました。カウント 30 と 12 が正確に 復元されました。別のトリミング済み、逆相補鎖化済み、2 レーンのフィクスチャでは 15、7、0 リードが 復元されました。2 グループのヘルパーは、500 ガイドと各条件 2 レプリケートを用いて、非ペアモードと ペアモードで検証しました。既知の枯渇遺伝子と濃縮遺伝子がそれぞれの方向で第 1 位にランクされ、FDR 0.05 を通過しました。スパースなフィクスチャで合計正規化のフォールバックを検証しました。これらの テストは実行とシグナルの方向を確立するものであり、実際のスクリーニングの統計的キャリブレーション ではありません。上記の実ファイルパスは例示です。

result/report.json には、カウント/ライブラリ/コントロールガイドの SHA-256、コントロールガイド ID、 MAGeCK バージョン、実際の引数、QC、適用された正規化、警告、ヒットの方向、FDR、log2 フォールド チェンジ、ランクが記録されます。ヘルパーは明示的に中央値ガイド LFC 集約と --remove-zero both を 選択します。オールゼロのガイドは入力/QC に残りますが、ランキングからは除外されます。ネイティブの MAGeCK もデフォルトで NA/na の遺伝子ラベルをスキップします。ヘルパーの --fdr は完了した 遺伝子結果をフィルタリングしますが、MAGeCK の --gene-test-fdr-threshold を設定するものでは ありません。これは RRA のガイド選択カットオフを制御します。負の FDR と正の FDR は別々のファミリー です。それらの和集合は、方向間または複数のコントラスト間での joint FDR 制御を確立するものでは ありません。screen.gene_summary.txt、screen.sgrna_summary.txt、正規化カウント、実行ログが 完全なエビデンスを保持します。解析の引き継ぎには、元のライブラリ、サンプルシート、ネガティブ コントロールリストを含めてください。カウントのチェックサムではそれらを再構築できません。

主な参照資料

• MAGeCK の使用法とコマンドのセマンティクス
• 公式のインストールガイダンス
• 入力フォーマット
• 出力フィールドの意味