qiime2-amplicon

QIIME 2 ペアエンド 16S アンプリコン

プライマー、品質エンコーディング、期待されるインサート長、およびサンプルメタデータが既知である、デマルチプレックス済みのペアエンド 16S アッセイに使用します。この限定的なワークフローは、リードをインポートし、5′ プライマーを除去し、DADA2 でデノイズし、明示的に指定された分類器を使用して ASV を分類し、.qza/.qzv のプロバナンスを保持します。リード数を絶対的な細胞数として扱ったり、分類群の割り当てを株の同定として扱ったりしないでください。

実行前にアッセイを確定する

• Phred+33、リードの向き、フォワード/リバースリードでシーケンスされたままのプライマー配列、およびプライマーがすでに除去されているかどうかを確認します。バンドルされたランナーは、5′ 末端にプライマーがまだ存在していることを前提としています。これは Cutadapt のマッチングをアンカーし、トリミングされていないペアを破棄します。すでにトリミング済みのリードには、その省略をプロバナンスに記録した上で、直接インポート → DADA2 のワークフローが必要です。
• 実際の塩基ごとの品質およびエラープロファイルからトリミング位置を選択します。trunc-f/r はプライマー除去後の位置です。期待される最大インサート長にもプライマーは含まれません。trunc_f + trunc_r - maximum_insert_length >= 12 を満たす必要があります。長さの変動に対する余裕を設けてください。このチェックは幾何学的なオーバーラップを予測するものであり、生物学的なマージの成功を予測するものではありません。
• 参照データベース、分類学的カバレッジ、向き、およびトレーニング手法がアッセイに適合する分類器を選択します。全長分類器がサポートされています。プライマー領域特異的なトレーニングは必須ではありません。その scikit-learn バージョンをインストール済み環境に正確に一致させてください（公式の 2026.7 ディストリビューションでは 1.7.1 に固定されています）。ソース URL、データベースバージョン、およびチェックサムを記録します。QIIME の現在のデータリソースページは、2026.4 以降について外部でホストされている分類器にリンクしています。その古いダウンロードは自動的に互換性があるわけではありません。任意の「最新」分類器を自動的に取得したり、互換性のないシリアライズされた sklearn モデルを再利用したりしないでください。sklearn 分類器アーティファクトは信頼できるソースからのみロードしてください。QZA 形式の検証は、信頼できないシリアライズされたモデルを安全にするものではありません。
• 可能な場合は、抽出ブランク、PCR 陰性対照、およびモックコミュニティを含めてください。ランナーは空の FASTQ を拒否します。空のコントロール ID は別途保持し、コントロールの証拠を黙って削除するのではなく報告してください。生態学的な解釈の前にコンタミネーションを評価してください。

入力ファイル

マニフェストはタブ区切りの PairedEndFastqManifestPhred33V2 ファイルで、正確に次のヘッダーを持ちます:

sample-id	forward-absolute-filepath	reverse-absolute-filepath
sample1	/data/sample1_R1.fastq.gz	/data/sample1_R2.fastq.gz

これはヘルパーの意図的に狭いマニフェストプロファイルです。実際のタブ文字、ランタイムから見えるリテラルの絶対パス（このヘルパーを呼び出す前に環境変数を展開してください）を使用し、サンプルごとに 1 行としてください。このマニフェストにはコメント/ディレクティブ行や追加の列を含めないでください。R2 ファイルを逆相補にしないでください。サンプルメタデータはタブ区切りのファイルで、最初の列が sample-id、マニフェストと一致する一意の ID、およびオプションの #q2:types アノテーションを持ちます。下流で必要な共変量と生物学的レプリケート ID を含めてください。 ヘルパーはメタデータ ID と行構造をチェックします。QIIME は実行中に完全なメタデータの型付け/ディレクティブ検証を行います。アクションによって使用されるメタデータはアーティファクトのプロバナンスに保持されるため、匿名化された生物学的レプリケート ID を使用してください。

実行

ヘルパーは scripts/amplicon_workflow.py にあります。以下のコマンドは、 スキルディレクトリが作業ディレクトリであることを前提としています。まず QIIME なしで検証してください。 これらのプライマーと長さの例は 説明用 であり、普遍的なアッセイ設定ではありません：

python scripts/amplicon_workflow.py validate \
  --manifest manifest.tsv --metadata sample-metadata.tsv \
  --primer-f GTGYCAGCMGCCGCGGTAA --primer-r GGACTACNVGGGTWTCTAAT \
  --trunc-f 220 --trunc-r 200 --amplicon-max 300

次に、互換性のある分類器を使用して QIIME 2 2026.7 環境で実行します。この研究固有の 呼び出しは説明用です。先行する品質検査またはパイロットを使用して長さを選択してください：

python scripts/amplicon_workflow.py run \
  --manifest manifest.tsv --metadata sample-metadata.tsv \
  --primer-f GTGYCAGCMGCCGCGGTAA --primer-r GGACTACNVGGGTWTCTAAT \
  --trunc-f 220 --trunc-r 200 --amplicon-max 300 \
  --classifier compatible-classifier.qza --threads 4 --output run01

run は即座に実行され、新規の出力ディレクトリにのみ書き込み、失敗した QIIME コマンドで停止します。すべてのペア FASTQ レコードをストリーミングして、ID/順序/数の不一致を検出し、 シーケンス/品質の一貫性とサンプルのアラインメントを確認し、最初の 1,000 リードペアを 正確な IUPAC プライマーマッチについてプロファイリングします。低い完全一致率は警告です：Cutadapt はミスマッチを許容しますが、 低い率は方向、アダプター、またはすでにトリミングされたデータが誤っていることを示す場合もあります。 サンプルごとに少なくとも 1 つの完全なペアが、名目上のプライマー後トランケーション長を満たす必要があります。 これらの長さ推定値は、記載されたプライマー長を差し引いたものであり、Cutadapt のインデル や品質フィルタリングをシミュレートするものではなく、いずれかのペアが実際にマージされることを保証するものでもありません。

ランナーは、出力セットが進化するプラグインメソッドに --output-dir を使用し、リリースによって提供される場合は Cutadapt 統計と DADA2 の塩基遷移アーティファクトを保持します。2026.7 のテーブル サマリーはまた、table.qzv の隣に feature-frequencies.qza と sample-frequencies.qza を生成します。 それは qiime-info.txt、commands.json、workflow.log、入力 QC、分類器チェックサム、および出力アーティファクト チェックサムを記録します。完了を報告する前に、最大レベルの QIIME アーティファクト検証を実行します。 リリースに固定されたランタイム、実際の検証範囲、再起動の処理、および科学的解釈については references/runtime-and-interpretation.md を参照してください。

分析前の結果の確認

trimmed.qzv、table.qzv、および taxa.qzv を、データに応じてローカルの QIIME 可視化環境または QIIME 2 View で開いてください。品質/長さプロファイル、 サンプルごとの深度、および優勢な分類群を調べます。元のアーティファクトを CSV/BIOM エクスポートで置き換えるのではなく保持してください：エクスポートは元のプロバナンスグラフを保持しません。

retention-qc.json は、生のペアを DADA2 入力および非キメラリードと比較するため、トリミングの損失が 可視化されたままになります。保持率 <50% はレビューのヒューリスティックであり、普遍的な拒否ルールではありません。 stats/stats.tsv の個々のステージを調べます：フィルタリング損失は品質/予想エラー 設定を示唆します。フォワードデノイジング後の損失にはリバースデノイジングとマージの失敗が含まれます。キメラ損失はライブラリ 品質とパラメータの見直しを要します。希釈化、多様性、または差分存在量の前に、欠損/ゼロサンプルとコントロールの挙動を調査してください。 これらの下流分析には別個の設計判断が必要です。このスキルは希釈化深度を自動的に選択しません。 スタンドアロンの retention stats.tsv サブコマンドは DADA2 入力カウントのみを認識します：それは raw_pairs: null を報告し、その分母を明示的に示します。このランナーによって生成されるような、マージのみのペア DADA2 統計をサポートします。保持された非マージ/連結リード統計は拒否します。

主要な参考文献

• 現在のインストールエントリポイント および アンプリコンドキュメント。
• インポート形式。
• Cutadapt アクション および DADA2 アクション。
• 分類器データリソース。

ローリングドキュメントは開発リリースを記述している場合があります。固定されたランナーを後のリリースに適合させる前に、 正確にインストールされた環境で qiime info とアクションの --help を確認してください。