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定量プロテオミクス — 推論スキル

概要

あなたは、定量プロテオミクスの実験計画と統計解析の専門家です。 ユーザーからプロテオミクスデータの定量戦略、欠損値の補完、正規化、または 差次的発現について質問された場合は、以下の判断フレームワークを適用してください。

使用方法

• 研究デザインに応じて、LFQ、TMT、DIA の定量戦略を選択する
• 欠損パターンとデータ特性に基づいて、補完方法と正規化方法を選択する

基本概念

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回答形式

• 直接的な推奨または分類から始める（3文以内）
• 次の順に構成する：推奨 → 根拠（具体的な基準やしきい値を示す）→ 注意点
• 比較には表を、基準の一覧には箇条書きを使用する
• ユーザーがすでに知っている背景情報は省略する — ユーザーは質問への回答を求めています
• 目安：200～400語。ただし、ユーザーが網羅的な説明を求めている場合を除く このスキルに含まれる判断ツリーとフレームワークは、内部推論専用です。結論を導くために適用しますが、回答で再掲しないでください。根拠を添えた最終的な推奨のみを提示してください。

1. 定量戦略の選択

1.1 判断ツリー

Is the goal discovery or targeted validation?
├─ Discovery (maximize coverage)
│  ├─ Sample count ≤ 20 → LFQ (label-free quantification)
│  ├─ Sample count 20–100 → TMT (multiplexed, up to 18-plex)
│  └─ Sample count any, need comprehensive coverage → DIA
├─ Targeted validation
│  └─ Use PRM (parallel reaction monitoring) or SRM/MRM
└─ Large clinical cohort (>100 samples)
   ├─ Budget allows multiplexing → TMT with fractionation
   └─ Budget constrained → DIA (single-shot)

1.2 主なルール

1. 厳密なバッチ補正計画がない限り、1つの研究内で定量戦略を混在させないでください。
2. LFQ では欠損を減らすためにラン間マッチング（MBR）が必要ですが、MBR によって誤った転送が発生することがあります（デフォルト設定で偽陽性率は約5％）。
3. DIA のライブラリフリーモード（DIA-NN ≥1.8）はよりシンプルです。ライブラリベースでは同定数が約10％増加します。
4. 生物学的反復は技術的反復より重要です。 条件ごとに最低3、臨床研究では5以上が必要です。
5. TMT の比率圧縮： MS2 レベルでは30～50％の過小評価を想定してください。真の FC ≈ 観測 FC × 1.5～2.0 です。SPS-MS3 では圧縮を10％未満に抑えられますが、同定数は約30％減少します。スパイクインによる真値がない場合、恣意的な補正は適用しないでください。

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2. 欠損値の評価と補完

2.1 補完の判断ツリー

Assess missingness pattern:
├─ >50% missing across ALL groups → Exclude protein (unreliable)
├─ Missing predominantly in one condition
│  └─ Likely MNAR → Use left-censored methods (MinProb, QRILC)
├─ Missing scattered across conditions
│  └─ Likely MAR → Use kNN, MLE, or BPCA
└─ Mixed pattern
   └─ Hybrid: classify each protein's missingness, apply appropriate method

2.2 補完方法と落とし穴

方法	メカニズム	使用する場面	落とし穴
MinProb	MNAR	LOD 未満の低存在量	分散を過小評価する
QRILC	MNAR	左側打ち切り分布	正規性を仮定する
kNN (k=10)	MAR	散発的な欠損	欠損が多すぎると機能しない
MLE (EM)	MAR	適切な MAR データ	多変量正規性を仮定する
BPCA	MAR	高次元データ	計算コストが高い

2.3 補完のルール

1. まず必ず欠損を可視化してください。 方法を選ぶ前に、ヒートマップと密度プロットを作成してください。
2. 補完の前にフィルタリングしてください。 欠損が50％を超えるタンパク質とコンタミナントを除去します。
3. MNAR パラメーター： 観測分布からの下方シフト = 1.8 SD、幅 = 0.3 SD。
4. 補完後にフィルタリングしてはいけません。 補完後のフィルタリングはデータセットにバイアスを与えます。
5. 感度分析： 主要なヒットが頑健であることを確認するため、補完ありと補完なしで DE を実施してください。

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3. 正規化戦略

3.1 判断ツリー

What is the expected biological variation?
├─ Most proteins unchanged between conditions (typical)
│  ├─ Default → Median centering (simple, robust)
│  ├─ Strong batch effects → Quantile normalization
│  └─ Variance depends on intensity → VSN
├─ Global shift expected (e.g., drug treatment affecting many proteins)
│  └─ Use spike-in standards, NOT data-driven methods
└─ TMT data
   └─ Sample loading normalization → then median centering within plex
└─ DIA data
   └─ Median centering on precursor quantities BEFORE protein roll-up

3.2 ルール

1. 正規化の前に強度を log2 変換してください（変換を含む VSN は除く）。
2. プロテオームの30％を超える部分が影響を受けている場合、分位点正規化を行わないでください。 実際の生物学的変化が覆い隠されます。
3. TMT には2段階の正規化が必要です： サンプルロードの正規化を行い、続いて内部参照スケーリングを行います。
4. バッチ補正（ComBat）は正規化とは別です。 まず正規化し、その後に補正します。
5. 箱ひげ図と MA プロットで確認してください。 正規化後の中央値は揃っている必要があります。

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4. 差次的発現の解釈

4.1 FC のしきい値とルール

1. FC のしきい値は生物学的特性によって異なります。 分泌バイオマーカー：|log2FC| > 0.5。細胞内：|log2FC| > 1.0。
2. limma よりも DEqMS が推奨されます。 ペプチド数の関数として分散をモデル化するためです。
3. 必ず調整済み p 値を使用してください。 未調整の p < 0.05 では、何百もの偽陽性が生じます。
4. 交絡因子を確認してください。 線形モデルの共変量として、バッチ、性別、年齢を含めます。

4.2 よくある間違い

• 誤り： プロテオミクスの差次的発現解析に標準的な t 検定を使用する 正解： limma（経験ベイズによるモデレート t 検定）または DEqMS（ペプチド数に基づく分散モデル化）を使用する 理由： 標準的な t 検定は、サンプル数が少ない場合に検出力が不十分です。モデレート統計量は、タンパク質間で情報を共有します。

• 誤り： フォールドチェンジのしきい値を設けず、p 値だけで差次的発現タンパク質をフィルタリングする 正解： 調整済み p 値 < 0.05 と、最小 |log2FC| しきい値（分泌タンパク質では ≥0.5、細胞内タンパク質では ≥1.0）の両方を必須とする 理由： 統計的に有意でも生物学的に意味の小さい変化（わずかな FC）は対応につながらず、結果を見づらくします。

• 誤り： 比率圧縮を考慮せず、TMT フォールドチェンジを額面どおりに解釈する 正解： SPS-MS3 による定量を使用するか、圧縮補正係数を適用する（真の FC ≈ 観測値 × 1.5–2.0） 理由： MS2 レベルの TMT では、共分離による干渉のため、フォールドチェンジが一貫して 30～50% 過小評価されます。

• 誤り： 汚染物質やリバースヒットタンパク質を解析に含める 正解： 正規化と統計検定の前に、CON__ および REV__ のプレフィックスが付いたエントリをすべて除外する 理由： 汚染物質は正規化を歪め、タンパク質数を水増しします。リバースヒットはデコイ配列です。

• 誤り： 正規化の後に欠損値を補完する 正解： 先に log2 変換し、次に補完してから正規化する 理由： 正規化済みデータを使った補完では、シフトした分布が参照値として用いられ、補完値に系統的なバイアスが生じます。

• 誤り： 単一のペプチドだけで同定されたタンパク質を定量解析に含める 正解： 確実な同定と定量のため、タンパク質ごとに固有ペプチドを ≥2 個必須とする 理由： 単一ペプチドによる同定は偽発見率が高く、定量の信頼性も低いためです。

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5. 研究デザインと QC

5.1 サンプルサイズのガイドライン

研究タイプ	最小	推奨
探索研究	群あたり 3	群あたり 5～6
バイオマーカー検証	群あたり 10	群あたり 20 以上
臨床プロテオミクス	群あたり 20	群あたり 50 以上

5.2 バッチ設計のルール

1. サンプルをバッチ間でランダム化します。 症例をすべて 1 つのバッチに、対照をすべて別のバッチにまとめてはいけません。
2. クロスプレックス正規化のため、すべての TMT プレックスにブリッジサンプルを含めます。
3. 交絡因子をブロックします。 バッチ間で年齢と性別のバランスを取ります。

5.3 QC チェックポイント

チェックポイント	許容範囲
1 ランあたりのタンパク質 ID 数	>4,000（LFQ）、>6,000（DIA）、>8,000（TMT）
強度の CV	テクニカルレプリケートで <20%
欠損率	<30%（LFQ）、<10%（TMT）、<15%（DIA）
レプリケート間の相関	Pearson r >0.95（テクニカル）、>0.85（生物学的）
PCA クラスタリング	レプリケートが一緒にクラスター化する

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6. 重要なしきい値のクイックリファレンス

• レプリケート間の CV > 20% → 調査対象としてランにフラグを付ける
• すべての群で欠損率が 50% を超えるタンパク質 → 補完前に除外する
• TMT 比率圧縮の補正： 真の FC ≈ 観測 FC × 1.5–2.0（MS2 レベル）
• プロテオームの 30% 超が差次的発現している場合、分位点正規化は禁止
• リン酸化プロテオミクス： 部位局在確率 >0.75 を必須とし、リン酸化タンパク質量を総タンパク質量で正規化する
• プロテオミクスとトランスクリプトミクスの相関は通常 r = 0.4–0.6 です。乖離は生物学的に有益な情報です（翻訳後制御）。

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7. クイックリファレンス：判断のまとめ

Quantification:  Small discovery → LFQ
                 Large cohort → TMT (with SPS-MS3)
                 Comprehensive → DIA

Imputation:      Low-abundance missing → MinProb / QRILC (MNAR)
                 Random missing → kNN / MLE (MAR)
                 Mixed → Hybrid approach

Normalization:   Default → Median centering
                 Batch effects → Quantile
                 Heteroscedastic → VSN
                 Global shift → Spike-in standards

DE Testing:      Default → limma (empirical Bayes)
                 Proteomics-aware → DEqMS
                 Threshold → adj.p < 0.05, |log2FC| > 1.0

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パイプラインのリファレンス

入力形式

ソース	ファイル	主要な列
MaxQuant	proteinGroups.txt	Protein IDs, Gene names, LFQ intensity *, iBAQ, Reverse, Potential contaminant
MSFragger	combined_protein.tsv	Protein, Gene, Intensity, Spectral Count
Proteome Discoverer	Proteins.txt	Accession, Description, Abundance *
DIA-NN	report.pg_matrix.tsv	Protein.Group, 定量値を含むサンプル列

TMT サンプルロードの正規化＋内部参照スケーリング

# TMT: Sample Loading Normalization + Internal Reference Scaling
col_sums <- colSums(mat, na.rm = TRUE)
scaling_factors <- median(col_sums) / col_sums
mat_sln <- sweep(mat, 2, scaling_factors, "*")

# IRS using bridge channel (e.g., pooled reference in 131C)
bridge <- mat_sln[, grep("131C", colnames(mat_sln))]
irs_factors <- apply(bridge, 1, median, na.rm = TRUE)
mat_irs <- mat_sln / irs_factors  # row-wise scaling across plexes

limma が失敗する場合

シナリオ	問題	代わりに使用
群あたりの反復数が 3 未満	分散の推定が信頼できない	RankProd（順位ベースで、分散の推定が不要）
不均衡なデザイン（例：3 対 8）	プールした分散が大きい群に偏る	混合モデル：lme4＋lmerTest
反復測定／縦断研究	サンプル間の相関が独立性の前提に反する	limma::duplicateCorrelation() または variancePartition の dream()
2 群を超える場合	ペアごとの t 検定では FDR が増大する	適切なコントラスト行列を用いた limma::contrasts.fit()
対応サンプル（例：腫瘍と隣接する正常組織）	患者の影響を考慮する必要がある	デザイン行列に患者をブロック因子として含める

パラメーターリファレンス

パラメーター	デフォルト	範囲	備考
MinProb 分位数（q）	0.01	0.001–0.05	値が小さいほど、より保守的な補完になります
MinProb のダウンシフト（σ）	1.8	1.4–2.0	平均からの標準偏差
MinProb の幅	0.3	0.2–0.5	補完値の広がりに用いる観測 σ の割合
kNN k	10	5–15	k が大きいほど滑らかになりますが、処理は遅くなります
kNN rowmax	0.5	0.3–0.7	行ごとに許容される欠損率の最大値
欠損値フィルター	1 つ以上の群で 70%	50–100%	厳しくするほど、タンパク質数が減り、ノイズも少なくなります
log2FC のしきい値	1.0	0.5–2.0	生物学的な状況に応じて調整します
adj.p のしきい値	0.05	0.01–0.1	厳格な探索では 0.01 を使用します
ユニークペプチドの最小数	2	1–3	信頼性の高い同定には 2 以上が必要です

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このスキルを使用しない場合

• 臨床アッセイ開発に向けてバイオマーカー候補を検証する場合（アッセイ化学の専門家が必要です）
• サンプル調製の問題が分散の主因である場合（分析上の問題ではなく、分析前の問題です）
• 同位体標識標準を必要とする絶対定量の場合

人間の専門家にエスカレーションする場合

• 欠損データが 50% を超え、補完の前提を検証できない場合
• 単一バッチの実験から得られた定量的な主張を公表する前
• 結果の解釈に質量分析法開発の専門知識が必要な場合

8. よくある問題のトラブルシューティング

症状	考えられる原因	解決策
タンパク質 ID が非常に少ない（<2,000）	サンプル調製不良または装置の問題	TIC を確認し、QC 標準を再測定します
PCA ですべてのサンプルがバッチごとにクラスタリングする	バッチ効果が生物学的な差を支配している	ComBat または limma removeBatchEffect を適用します
有意な DE タンパク質がない	検出力不足の研究、または不適切な検定	サンプルサイズを確認し、DEqMS を使用するか、FC のしきい値を緩和します
有意なヒットが多すぎる（>50%）	正規化の失敗または全体的なシフト	箱ひげ図を確認し、スパイクイン正規化を検討します
補完によって人工的なクラスターが生じる	MNAR 補完が強すぎる	ダウンシフトを小さくする、kNN を試す、またはより厳しくフィルタリングします
TMT のフォールド変化が予想より小さい	比率圧縮	SPS-MS3 を使用するか、圧縮補正を適用します
反復間の CV が高い（>30%）	サンプル調製のばらつき	消化プロトコルを見直し、QC サンプルを追加します