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RELION 単粒子解析リファインメント

RELION の単粒子プロジェクト、特に抽出済み粒子 → 均一に選択された粒子サブセット → ゴールドスタンダードリファインメント → ハーフマップ検証とポストプロセッシング、という流れに使用します。同梱のランナーは、CTF がアノテーションされた抽出済み粒子と初期 3D 参照から開始します。モーション補正、ピッキング、2D/3D 選択、マップ品質の生物学的解釈を置き換えるものではありません。トモグラフィー、ヘリカル再構成、Blush、不均一状態モデリングについては、それらのデータをこの限定された SPA ランナーに押し込むのではなく、適切な上流ワークフローを使用してください。

取得条件と座標の規約を維持する

ムービーから開始する場合やジョブを再開する場合は、references/acquisition-and-restarts.md を参照してください。ピクセルサイズは Å/ピクセル、電圧は kV、球面収差は mm、デフォーカスは Å、振幅コントラストは割合、対称性は試料によって正当化されるものを確認してください。疑わしい値を単位の推測によって「修正」しないでください。

data_optics は取得条件/イメージグループを記述し、data_particles は _rlnOpticsGroup を通じてそれらを参照します。粒子のファイル名は 1 始まりの [email protected] を使用します。[email protected] のような先頭のゼロは有効です。相対パスは STAR ファイルのディレクトリではなく、RELION プロジェクトディレクトリから解決されます。STAR ファイルをマージまたはサブセット化する際はオプティクスグループを保持してください。_rlnOriginXAngst/_rlnOriginYAngst はピクセルではなく Å 単位の並進量です。

このスキルディレクトリから、実際のプロジェクトへのパスを指定して実行します:

python scripts/spa_workflow.py validate-star project/particles.star --project project

これは参照されているスタックを開き、オプティクスメンバーシップ、有限の取得条件/CTF 値、インデックス、ボックスサイズ、重複する粒子参照、既存のハーフセット割り当てをチェックします。スタックが本当に利用できない場合にのみ --metadata-only を使用してください。JSON には stack_checks_performed: false が記録されます。すべての粒子ピクセルを破損についてスキャンしたり、正しい画像正規化を確立したりするものではありません。物理的範囲の警告はレビューを促すものであり、異常な顕微鏡設定が誤っていることの証明ではありません。

選択された粒子集団をリファインする

実行前に、代表的な粒子とクラス平均、デフォーカス分布、CTF フィット、粒子の配向分布、初期参照を確認してください。ダウンサンプリング後もマップと粒子のボックス/ピクセルサイズが一致していることを確認してください。このランナーは、オプティクスグループ間で単一の有効なボックス/ピクセルサイズを意図的にサポートしています。不均一なサンプリングは、明示的な上流のリサンプリングワークフローで処理してください。すでに位相反転やウィーナーフィルタリングが行われていない、慣例的に抽出・正規化された粒子を使用してください。このランナーはそれらの特殊な入力ケースを設定しません。

python scripts/spa_workflow.py refine \
  --star project/particles.star --reference project/initial.mrc \
  --project project --diameter 180 --symmetry C1 \
  --initial-lowpass 40 --mpi-ranks 3 --threads 2 --output project/RefinePilot

上記の直径とローパスフィルターは例示的な Å の値です。試料に適した値を使用してください。リファインメントは mpirun -np 3 relion_refine_mpi を --auto_refine、--split_random_halves、--ctf、およびローパス初期参照とともに実行します。ゴールドスタンダード分割には MPI が必要です。通常の逐次実行の relion_refine 実行ファイルではこの分割を実行できません。MPI インストールを一致させた上で、奇数ランク ≥3（マスターとバランスの取れたハーフセットワーカー）を使用してください。CPU コマンドは限定的なパイロットに有用です。完全なデータには文書化された GPU/MPI 起動方法を選択してください。

ランナーはコマンド、ネイティブバージョン、ログを新しい出力ディレクトリに保持し、明示的なランダムシード（デフォルト 1）を記録し、実行時の警告を表示し、プロセス失敗時に停止し、成功を報告する前に収束した未フィルタリングのハーフマップを要求します。高コストなジョブを自動的に再試行したり、失敗したジョブの成果物を黙って破棄したりすることはありません。再開のために _optimiser.star、モデル/サンプリング STAR ファイル、および参照されている粒子パスを保持してください。部分的に処理されたテーブルから新しいランダム分割を開始するのではなく、元のジョブのオプティマイザーを使用してください。

独立したハーフマップの検査

独立して精緻化された 2 つのフィルタリングなしのハーフマップを使用し、結合されてシャープニングされたマップの 2 つのコピーは決して使用しないでください。ヘッダーが一致していても統計的な独立性は証明できません。独立した粒子の割り当てと精緻化の履歴がその証拠となります。方向依存の異方性、優先配向、局所分解能に加え、全体的な FSC 曲線も検査してください。

python scripts/spa_workflow.py fsc \
  project/RefinePilot/run_half1_class001_unfil.mrc \
  project/RefinePilot/run_half2_class001_unfil.mrc --output diagnostic-fsc.tsv

これはマップの次元、有限値、ピクセルサイズ、原点、軸の順序、重複マップをチェックし、マスクなしの診断用 FSC を出力します。報告される 0.143 の交差は線形補間を使用しています。null は下方向への交差が検出されなかったことを意味し、無限の分解能を意味するものではありません。ナイキスト分解能は 2 × ピクセルサイズです。この診断は 256³ 以下の偶数立方マップに限定されます。より大きなマップには RELION ネイティブの relion_image_handler --fsc を使用してください。これはマスク補正済み FSC の代わりにはなりません。このヘルパーは、正準軸、MRC の開始インデックスがゼロ、直交するセル角度を持つ実空間マップを必要とします。その他のグリッドは来歴を明示して変換してください。ヘッダーを編集するだけでは密度がずれる可能性があります。ヘッダーの一致と FSC では絶対的な手性を判断できません。

ソフトマスクによるポストプロセス

溶媒マスクは、適切にローパスフィルタリングされた密度から、境界を拡張し、エッジを滑らかにして構築してください。すべてのスライスを検査してください。タイトなマスクは相関を過大評価する可能性があります。ハーフマップ間で共有される高周波ノイズから導出されたマスクは避けてください。

python scripts/spa_workflow.py postprocess \
  --half1 project/RefinePilot/run_half1_class001_unfil.mrc \
  --half2 project/RefinePilot/run_half2_class001_unfil.mrc \
  --mask project/soft_mask.mrc --output project/PostProcessPilot

このヘルパーは、[0,1] の範囲にある非定数マスク、ソフトエッジのボクセル、一致するマップグリッドをチェックしたうえで、ハーフマップ、マスク、ピクセルサイズを明示して relion_postprocess を実行します。RELION は独自のマスク/ランダム化補正を実行し、postprocess.star を出力します。この制限されたコマンドは B ファクターをゼロのままにします（自動 B ファクター推定は行いません）。自動/手動シャープニングは、妥当なフィット範囲を選択し、マップ品質を検査した後にのみ追加してください。有効な範囲といくつかの小数のマスクボクセルは、マスクが科学的に適切であることを証明するものではありません。報告された分解能付近における位相ランダム化されたマスク付き FSC を検査してください。残留相関がある場合は、より滑らかで広いマスクと、ポストプロセスの再実行が必要です。

テスト済みのネイティブユーティリティと、パイプライン実行と再構成検証の違いについては、references/runtime-and-validation.md を参照してください。

主要な参考文献

• RELION 5.0 installation。
• STAR and map conventions。
• Single-particle tutorial。
• Gold-standard refinement。
• Mask creation and postprocessing。