mcpField
S
sgrna-design-guide

sgrna-design-guide

github.com/jaechang-hitsその他38469 回インストール6 日前に更新
リポジトリ

sgrna-design-guide について

このガイドは、検証済み配列、CRISPick の事前計算データ、de novo 設計の順に sgRNA を選ぶ方法を研究者向けにまとめています。Cas 変異体との適合、スコアによる選定、設計ルール、実験検証を扱います。

主な機能

  1. 01三段階の手順で sgRNA を選定
  2. 02検証済み配列と文献を検索
  3. 03CRISPick の順位で候補を絞り込み
  4. 04Cas 変異体と PAM を照合
  5. 05de novo 設計ルールを適用

活用シーン

  1. 01遺伝子ノックアウト用 sgRNA を選定
  2. 02CRISPRa・CRISPRi 用ガイドを選択
  3. 03非モデル生物向けガイドを設計
  4. 04候補ガイドの特異性を確認

インストール

コマンドをコピーしてターミナルで実行します。

$npx skills add https://github.com/jaechang-hits/sciagent-skills --skill sgrna-design-guide

インストール後、Claude Code で/sgrna-design-guideを入力して読み込まれたか確認します。

同梱ファイルresource/addgene_grna_sequences.csvresource/CRISPick_download_links.txt

詳細

sgRNA 設計ガイド：3 段階のアプローチ

メタデータ

概要：検証済み配列、CRISPick データセット、または de novo 設計ツールを使用して sgRNA を見つける、または設計するための包括的なガイドです。

著者：Ohagent Team

バージョン：1.0

最終更新日：2025 年 11 月

ライセンス：CC BY 4.0

商用利用：許可

引用と謝辞

データベースの検証済み sgRNA を使用する場合（オプション 1）：
CRISPick の設計を使用する場合（オプション 2）：
  • 謝辞の文言：「ガイド設計は Broad Institute の GPP が提供する CRISPick ウェブツールによるものです」
  • Cas9 設計の引用（SpCas9、SaCas9）：Sanson KR, et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nat Commun. 2018;9(1):5416. PMID: 30575746
  • Cas12a 設計の引用（AsCas12a、enAsCas12a）：DeWeirdt PC, et al. Optimization of AsCas12a for combinatorial genetic screens in human cells. Nat Biotechnol. 2021;39(1):94-104. PMID: 32661438
    • 注：この論文では enAsCas12a の最適化について説明されています。方法には使用したバリアントを明記してください

概要

このガイドでは、検証済み配列を優先し、その後に計算による予測へ進む、3 段階の sgRNA 設計アプローチを紹介します。必ずオプション 1 から始め、必要な場合にのみ次のオプションへ進んでください。

主な概念

検証済み sgRNA データベース（第 1 段階）

検証済み sgRNA とは、公開研究で実験的に試験され、細胞株、切断効率、および（多くの場合）オフターゲットの特性評価が記録されたガイド配列です。Addgene は、こうした配列を含む寄託プラスミドと併せて配列を管理しています。また、ダウンロード可能な CSV（addgene_grna_sequences.csv）には、遺伝子記号、標的種、用途（切断／活性化／RNA 標的化）をキーとする検索可能な索引が収録されています。検証済み sgRNA の使用が推奨されるのは、CRISPR 実験が失敗する最大の原因がオンターゲット活性の低さであり、これは元の検証時に検出されていたためです。

計算による sgRNA スコアリング（第 2 段階）

検証済み sgRNA がない場合は、Broad Institute の CRISPick サービスによる、ゲノム全体を対象とした事前計算済みの設計が次善の選択肢です。CRISPick は、複数のゲノム、Cas バリアント、用途を網羅する 238 個のデータセットを提供しており、各候補ガイドはオンターゲット効率（どれだけ確実に切断するか）、オフターゲット特異性（他の部位を切断する可能性の低さ）、および両方のバランスを取る統合ランクで順位付けされています。CRISPick が使用するオンターゲットモデルは、Sanson 2018（Cas9）と DeWeirdt 2021（Cas12a）です。統合ランクが推奨されるデフォルトです。実験で一方を特に優先する場合に限り、オンターゲットまたはオフターゲットのランクを使用してください。

オフターゲットの厳格さと PAM との適合性

PAM（プロトスペーサー隣接モチーフ）の要件は Cas バリアントによって異なります。SpCas9 には NGG（3'）、SaCas9 には NNGRRT（3'）、AsCas12a および enAsCas12a には TTTV（5'）が必要です。重要なのは、AsCas12a と enAsCas12a は異なる酵素であるという点です。enAsCas12a は活性範囲が拡張された改変バリアントであり、一方に最適化されたガイドが、もう一方でも同じように機能するとは限りません。CRISPick データセットは、ラボで使用する Cas バリアントと必ず一致させてください。オフターゲットの厳格さのしきい値（通常は Off-Target Rank または CFD 形式のスコア）では、特異性と候補プールの規模の間にトレードオフがあります。しきい値を厳しくすると、候補数は減りますが、より高品質なガイドが得られます。

De Novo 設計ルール（Tier 3）

検証済み配列も事前計算済みデータセットもターゲットをカバーしていない場合（非モデル生物、カスタム遺伝子座など）は、ルールベースの設計を適用します。SpCas9／SaCas9 では 20 bp のプロトスペーサー（Cas12a では 23～25 bp）、GC 含量 40～60％とし、TTTT（Pol III ターミネーター）や 4 塩基を超えるホモポリマーの連続を避けます。ターゲットの位置も重要です。ノックアウトでは初期エクソン（コード配列の最初の 50％）、CRISPRa では TSS から −200～+1、CRISPRi では TSS から −50～+300 をターゲットにします。

判断フレームワーク

sgRNA design decision tree
└── Does Addgene database (Tier 1) contain a validated sgRNA for your gene + species + application?
    ├── Yes -> Use the validated sgRNA(s); cite the original PubMed reference
    └── No  -> Run advanced literature search (mandatory before Tier 2)
        ├── Found in literature -> Use the literature sgRNA; cite the paper
        └── Still no match -> Is the target organism + Cas variant covered by a CRISPick dataset (Tier 2)?
            ├── Yes -> Download dataset, filter by gene, sort by Combined Rank
            │         └── Pick top 3-4 sgRNAs (ideally from different exons for redundancy)
            └── No  -> De novo design (Tier 3) using 20 bp / PAM / GC / avoid-TTTT rules
                      └── Validate experimentally (Sanger / T7E1 / amplicon-seq)
状況推奨 Tier根拠
CRISPR に関する既報のある一般的なヒト／マウス遺伝子Tier 1（Addgene + 文献）検証済み配列には実測された切断効率が付随しており、実験上のリスクが最も低くなります
モデル生物のゲノム規模スクリーニングTier 2（CRISPick）事前計算済みデータセットが全ゲノムをカバーし、一貫したスコアリングを提供します
Addgene で該当がない、単一のヒト遺伝子ノックアウトTier 2（CRISPick GRCh38 SpCas9 CRISPRko）、Combined Rank でフィルタリング単発のノックアウトにおいて、効率と特異性のバランスが最も優れています
CRISPRa／CRISPRi 実験一致する CRISPRa／CRISPRi データセットを使用した Tier 2活性化／抑制モデルでは、コードエクソンではなく近位プロモーター領域をターゲットにします
Cas12a（AsCas12a と enAsCas12a）正確に一致する Cas12a バリアントのデータセットを使用した Tier 2一方のバリアント向けのガイドは、もう一方と互換性がありません
CRISPick でカバーされていない非モデル生物Tier 3（de novo ルール）ハイスループットの学習データが存在しないため、ルールベースの設計と実験検証が必要です
小規模なカスタム遺伝子座（例：人工カセット）Tier 3遺伝子座がどの参照ゲノムにも含まれていないため、ターゲット配列に直接基づいて設計します
最大限の特異性が必要な場合（例：治療への応用）Off-Target Rank で並べ替えた Tier 2予測されたオフターゲット部位が最も少ないガイドを優先します
最大限の切断効率が必要な場合（例：編集が難しい細胞株）On-Target Rank で並べ替えた Tier 2活性との引き換えに、オフターゲットリスクがやや高くなることを許容します

ベストプラクティス

  1. Tier 2 に進む前に、必ず Tier 1 を徹底的に確認してください。 addgene_grna_sequences.csv で該当する行が見つからなくても、文献検索の手順（Method 2）を実行してください。検証済み sgRNA の多くは補足資料に掲載されていますが、Addgene には登録されていません。
  2. CRISPick のデータセットを Cas バリアントに正確に一致させてください。 AsCas12a と enAsCas12a は別個の酵素であり、SpCas9 と SaCas9 では異なる PAM が必要です。誤ったデータセットを使うと、実験リソースが無駄になります。
  3. 既定の選択基準として Combined Rank を使用してください。 オンターゲット効率とオフターゲット特異性のバランスが取れています。On-Target Rank または Off-Target Rank を使用するのは、実験に特定の優先事項がある場合に限ってください。
  4. ターゲット遺伝子ごとに、できれば異なるエクソンから 3～4 個の sgRNA を注文してください。 予測スコアとは無関係な理由（クロマチンの状況、二次構造、PCR での脱落）で、単一のガイドが失敗することがあります。冗長性を持たせるのは、低コストでできるリスク対策です。
  5. ノックアウトでは、コード配列の最初の 50％をターゲットにしてください。 N 末端での切断は、NMD を介した真の機能喪失を引き起こす可能性が最も高くなります。一方、C 末端での切断では、部分的に機能するタンパク質が残ることがあります。
  6. CRISPRa は TSS から −200～+1 bp 以内、CRISPRi は −50～+300 bp 以内で設計してください。 エフェクターの活性は、これらの領域を外れると急激に低下します。
  7. 実験で検証してください。 ランクの高いガイドでも、約 20～30％の確率で失敗します。表現型アッセイに進む前に、サンガーシーケンシング、T7E1、ICE、またはアンプリコンシーケンシングで編集を確認してください。
  8. Tier 1 では元の検証論文を、Tier 2 では CRISPick と Sanson 2018／DeWeirdt 2021 を引用してください。 再現性を確保するには、すべてのガイド配列の出典を追跡可能にする必要があります。

よくある落とし穴

  • 落とし穴：Addgene CSV でヒットがない場合に、文献検索のステップ（方法 2）を省略する。

    • 回避方法：方法 2 は必須として扱ってください。検証済みガイドの多くは、公開論文の補足資料にしか掲載されていません。

  • 落とし穴：AsCas12a と enAsCas12a のどちらも TTTV PAM を共有しているため、AsCas12a 用のガイドを enAsCas12a で（またはその逆で）使用する。

    • 回避方法：CRISPick データセットのファイル名にある Cas タグ（AsCas12a と enAsCas12a）を、実験で使用する酵素バリアントと正確に一致させてください。

  • 落とし穴：On-Target Rank だけで並べ替えた結果、活性が高く特異性が低いガイドを選び、オフターゲット編集が生じる。

    • 回避方法：デフォルトでは Combined Rank を使用してください。実験で極端な効率または特異性が明示的に求められる場合に限り、別の順位付けを使用してください。

  • 落とし穴：遺伝子ごとに sgRNA を 1 つだけ設計し、それが機能しなかったときに「ガイドは機能しない」と結論付ける。

    • 回避方法：必ず、独立した遺伝子座／エクソンを対象とする遺伝子ごとに 3～4 個のガイドを注文してテストしてください。

  • 落とし穴：ノックアウトのために、後半のエクソンや 3' UTR を標的にする。 後半のエクソン編集で生じる短縮タンパク質は、一部機能を保つことが多く、表現型の解釈を難しくします。

    • 回避方法：ノックアウトでは、候補をコード配列の最初の 50％（または最初の 3 つのエクソン）に限定してください。

  • 落とし穴：CRISPRa または CRISPRi 実験に CRISPRko データセットを使用する。 プロトスペーサーのウィンドウは異なります。ノックアウトではコードエクソン、活性化／阻害では近位プロモーターが対象です。

    • 回避方法：用途タグ（CRISPRko／CRISPRa／CRISPRi）が実験に一致するデータセットをダウンロードしてください。

  • 落とし穴：TTTT を含むガイドを設計する。 この配列は RNA Pol III の転写を終結させるため、sgRNA は U6 プロモーターから発現しません。

    • 回避方法：de novo 設計した配列は必ず TTTT と 4 塩基を超えるホモポリマー配列をフィルタリングし、Tier 1／2 の候補も再確認してください。

  • 落とし穴：検証済み sgRNA の元の論文を引用し忘れる。

    • 回避方法：Addgene CSV の PubMed_ID（または文献検索で見つけた DOI）を設計記録の一部として記録し、方法のセクションに含めてください。

オプション 1：検証済み sgRNA 配列を検索する（最初に推奨）

1.1 検証済み sgRNA を検索する

重要：オプション 2 に進む前に、方法 1 と方法 2 の両方を必ず完了してください。方法 1 で結果が見つからない場合でも、方法 2 を省略しないでください。

方法 1：データベースを検索する（最速）

実験的な根拠がある、Addgene 由来の検証済み sgRNA 配列を 300 件以上収録したキュレーション済みデータベースを用意しています。

場所：resource/addgene_grna_sequences.csv（このスキルディレクトリからの相対パス）

データベースを検索する：

import pandas as pd

# Load the database
df = pd.read_csv('addgene_grna_sequences.csv')

# Search for your gene
gene_name = "TP53"
results = df[df['Target_Gene'].str.upper() == gene_name.upper()]

# Filter by species and application
results_filtered = results[
    (results['Target_Species'] == 'H. sapiens') &
    (results['Application'] == 'cut')  # or 'activate', 'RNA targeting'
]

# Display results with references
print(results_filtered[['Target_Gene', 'Target_Sequence',
                        'Plasmid_ID', 'PubMed_ID', 'Depositor']])

データベースの列：

  • Target_Gene：遺伝子記号
  • Target_Species：生物種（H. sapiens、M. musculus など）
  • Target_Sequence：20 bp の sgRNA 配列（5' から 3'）
  • Application：切断（ノックアウト）、活性化（CRISPRa）、RNA 標的化（CRISPRi）
  • Cas9_Species：S. pyogenes、S. aureus など
  • Plasmid_ID：Addgene プラスミド番号
  • Plasmid_URL：プラスミドページへの直接リンク
  • PubMed_ID：論文の参照情報（研究で引用してください）
  • PubMed_URL：論文への直接リンク
  • Depositor：配列を提供した研究室
方法 2：高度なウェブ検索（必須 — 省略しないでください）

重要：方法 1 で結果が見つからなかった場合でも、オプション 2 に進む前に、必ずこの文献検索を実施してください。検証済みの sgRNA の多くは文献で公開されていますが、Addgene データベースには登録されていません。

ohagent.tool.literature の advanced_web_search_claude を使用して、文献やデータベースから検証済みの sgRNA を探してください。

from ohagent.tool.literature import advanced_web_search_claude

# Example usage
results = advanced_web_search_claude("sgRNA TP53 validated H. sapiens experimental")

試す検索クエリ（複数使用してください）：

"sgRNA" OR "guide RNA" "[GENE_NAME]" validated experimental
"CRISPR knockout" "[GENE_NAME]" sgRNA sequence validated
"[GENE_NAME]" sgRNA "cutting efficiency" OR "on-target"
"[GENE_NAME]" "guide sequence" CRISPR validated

TP53 の例：

"sgRNA" "TP53" validated "H. sapiens" experimental
"CRISPR knockout" "TP53" guide sequence validated

検索結果で確認する項目：

  • 検証済み sgRNA 配列を含む公開論文
  • sgRNA 配列を含む補足資料
  • その他の CRISPR データベース（例：GenScript、Horizon Discovery）
  • 特定の sgRNA 配列を記載した実験プロトコル

重要：文献検索に十分な時間をかけてください。少なくとも最初の 10～15 件の検索結果に目を通し、関連論文の補足資料を確認してください。

検索結果の扱い：

一致する sgRNA が見つかった場合（どちらかの方法で）：

  1. sgRNA 配列を記録する（20 bp の標的配列）
  2. 出典を記録する：
    • データベースの場合：元論文を引用するために PubMed_ID を使用します
    • ウェブ検索の場合：出版物の DOI／PubMed ID を記録します
  3. 検証の詳細を記録する：細胞株、切断効率、報告されているオフターゲット

結果の形式例：

Gene: TP53
sgRNA sequence: GAGGTTGTGAGGCGCTGCCC
Species: H. sapiens (human)
Application: Knockout (cut)
Reference: PubMed ID 24336569 (Ran et al., 2013)
Validation: Tested in HEK293T cells, 85% cutting efficiency

方法 1 と方法 2 の両方で一致するものが見つからない場合： その場合に限り、オプション 2：CRISPick データセットをダウンロードに進んでください。

オプション 2：CRISPick から事前計算済み sgRNA をダウンロードする

このオプションを使用する場面
  • Addgene で検証済み sgRNA が見つからない
  • 遺伝子を幅広く網羅する必要がある
  • 予測スコア付きの sgRNA 候補を複数必要としている
  • ゲノム規模のスクリーニングに取り組んでいる
2.1 CRISPick の概要

CRISPick（Broad Institute GPP 提供）では、全ゲノムを対象に事前計算された sgRNA 設計を提供しており、以下を網羅する 238 種類のデータセットが利用できます。

  • ヒト（GRCh38、GRCh37）
  • マウス（GRCm38、GRCm39）
  • イヌ、ウシ、サル、その他のモデル生物
  • 複数の Cas 酵素（SpCas9、SaCas9、AsCas12a、enAsCas12a）
    • 重要：AsCas12a と enAsCas12a は異なる酵素です
    • AsCas12a：野生型 Acidaminococcus sp. Cas12a
    • enAsCas12a：活性が向上した改良型
    • 重要：enAsCas12a 用に設計された sgRNA は、野生型 AsCas12a では機能しない場合があります
    • データセットは、使用する Cas12a のバリアントに必ず合わせてください
  • 異なる用途（ノックアウト、活性化、阻害）
2.2 ダウンロードリンクを探す

238 件すべてのダウンロードリンクは：このスキルディレクトリからの相対パスである resource/CRISPick_download_links.txt にあります

ステップ 1：ファイル名の規則を理解する

ファイル名の形式：sgRNA_design_{TAXID}_{GENOME}_{CAS}_{APPLICATION}_{ALGORITHM}_{SOURCE}_{DATE}.txt.gz

一般的なデータセット：

| 生物種 | ゲノム | Cas9 | 用途 | 検索パターン | |-|--||-|-| | ヒト | GRCh38 | SpCas9 | ノックアウト | 9606_GRCh38_SpyoCas9_CRISPRko | | ヒト | GRCh38 | SpCas9 | 活性化 | 9606_GRCh38_SpyoCas9_CRISPRa | | ヒト | GRCh38 | SaCas9 | ノックアウト | 9606_GRCh38_SaurCas9_CRISPRko | | マウス | GRCm38 | SpCas9 | ノックアウト | 10090_GRCm38_SpyoCas9_CRISPRko | | マウス | GRCm38 | SpCas9 | 活性化 | 10090_GRCm38_SpyoCas9_CRISPRa |

主な構成要素：

  • TAXID：9606（ヒト）、10090（マウス）、9615（イヌ）、9913（ウシ）
  • CAS：
    • SpyoCas9（SpCas9、NGG PAM）
    • SaurCas9（SaCas9、NNGRRT PAM）
    • AsCas12a（野生型 Cas12a、TTTV PAM）
    • enAsCas12a（改良型 Cas12a、TTTV PAM）
    • 警告：enAsCas12a を使用する場合は AsCas12a のデータセットを使用しないでください。その逆も同様です
  • APPLICATION：CRISPRko（ノックアウト）、CRISPRa（活性化）、CRISPRi（阻害）
ステップ 2：ダウンロード URL を探す
# Search the download links file
grep "9606_GRCh38_SpyoCas9_CRISPRko" resource/CRISPick_download_links.txt

# Or for mouse
grep "10090_GRCm38_SpyoCas9_CRISPRko" resource/CRISPick_download_links.txt
ステップ 3：ダウンロードして展開する
# Copy the URL from download_links.txt, then:
wget [PASTE_URL_HERE]

# Extract the file
gunzip sgRNA_design_*.txt.gz

ファイルサイズ：ノックアウト（300～700 MB）、活性化（50～100 MB）、サマリーファイル（1～3 MB）

2.4 ファイル形式を理解する

.txt ファイルはタブ区切りです。ノックアウト用と活性化／阻害用のデータセットでは、列名が異なります。

必須列（すべてのファイル）：

  • sgRNA 配列：20 bp のガイド RNA 配列（5' から 3'）
  • 標的遺伝子シンボル：遺伝子名（例：「TP53」、「BRCA1」）
  • 総合ランク：総合順位（数値が小さいほど良い）— デフォルトではこれを使用してください
  • オンターゲットランク：効率のみで評価した順位（数値が小さいほど良い）
  • オフターゲットランク：特異性のみで評価した順位（数値が小さいほど良い）
  • PAM 配列：PAM 配列（例：「AGG」、「TGG」）

ノックアウト固有の列：

  • sgRNA 切断位置（1-based）：切断部位のゲノム座標
  • エクソン番号：標的となるエクソン
  • 標的切断率（%）：影響を受けるタンパク質の割合

活性化／阻害固有の列：

  • sgRNA「切断」位置：遺伝子を基準とした位置
  • sgRNA「切断」部位の TSS オフセット：転写開始部位からの距離（bp）
  • DHS スコア：DNase 高感受性スコア（CRISPRa 用）
2.5 sgRNA を抽出して選択する
ステップ 1：データを読み込み、対象遺伝子でフィルタリングする
import pandas as pd

# Load the dataset
df = pd.read_csv('sgRNA_design_9606_GRCh38_SpyoCas9_CRISPRko_*.txt',
                 sep='\t', low_memory=False)

# Filter for your gene
gene_name = "TP53"
gene_sgrnas = df[df['Target Gene Symbol'] == gene_name].copy()

print(f"Found {len(gene_sgrnas)} sgRNAs for {gene_name}")
ステップ 2：上位の sgRNA を選択する

デフォルト：総合ランクを使用する（効率と特異性のバランスを取ります）

# Sort by Combined Rank (lower is better)
top_sgrnas = gene_sgrnas.nsmallest(10, 'Combined Rank')

print(top_sgrnas[['sgRNA Sequence', 'Combined Rank',
                   'Exon Number', 'sgRNA Cut Position (1-based)']])

オプション A：オンターゲット効率を優先する

# Sort by On-Target Rank (for maximum cutting efficiency)
efficient_sgrnas = gene_sgrnas.nsmallest(10, 'On-Target Rank')

オプション B：オフターゲット特異性を優先する

# Sort by Off-Target Rank (for maximum specificity)
specific_sgrnas = gene_sgrnas.nsmallest(10, 'Off-Target Rank')
ステップ 3：独自の基準でフィルタリングする（任意）

エクソン番号でフィルタリングする：

# Target specific exon (e.g., exon 5)
exon5_sgrnas = gene_sgrnas[gene_sgrnas['Exon Number'] == 5]
top_exon5 = exon5_sgrnas.nsmallest(5, 'Combined Rank')

ゲノム位置でフィルタリングする：

# Target specific genomic range
position_filtered = gene_sgrnas[
    (gene_sgrnas['sgRNA Cut Position (1-based)'] >= 7572000) &
    (gene_sgrnas['sgRNA Cut Position (1-based)'] <= 7575000)
]

ノックアウトでは初期のエクソンを標的にする：

# Get sgRNAs from first 3 exons
early_exons = gene_sgrnas[gene_sgrnas['Exon Number'] <= 3]
top_early = early_exons.nsmallest(10, 'Combined Rank')

標的切断率でフィルタリングする：

# Target sgRNAs that affect significant portion of protein
high_impact = gene_sgrnas[gene_sgrnas['Target Cut %'] <= 50]  # Cut in first 50%
top_high_impact = high_impact.nsmallest(10, 'Combined Rank')
ステップ 4：検証用に複数の sgRNA を選択する
# Get top 4 sgRNAs from different exons for redundancy
final_selection = gene_sgrnas.sort_values('Combined Rank').groupby('Exon Number').head(1).head(4)

# Save results
final_selection.to_csv(f'{gene_name}_selected_sgRNAs.csv', index=False)

print("\nSelected sgRNAs:")
print(final_selection[['sgRNA Sequence', 'Exon Number', 'Combined Rank']])
2.6 結果の活用方法

sgRNA を選択したら：

  1. 3～4 個の sgRNA を選択します（デフォルトでは Combined_Rank を使用してください）

データセットに対象の遺伝子または生物種が含まれていない場合： オプション 3：sgRNA の de novo 設計に進みます

オプション 3：sgRNA 設計の一般的なガイドライン（最終手段）

このオプションを使用する場合
  • CRISPick のデータセットに対象の遺伝子が含まれていない
  • モデル生物ではない
  • 独自の設計要件がある
一般的な設計ルール
必須要件：
  1. 長さ：
    • SpCas9 および SaCas9 では 20 bp
    • Cas12a バリアント（AsCas12a、enAsCas12a）では 23～25 bp
  2. PAM 配列：
    • SpCas9：標的の直後（3' 末端）に NGG が必要です
    • SaCas9：標的の直後（3' 末端）に NNGRRT が必要です
    • AsCas12a（野生型）：標的の前（5' 末端）に TTTV が必要です
    • enAsCas12a（高性能型）：標的の前（5' 末端）に TTTV が必要です
    • 重要：enAsCas12a 用に設計されたガイドは、活性プロファイルが異なるため、野生型 AsCas12a では機能しない場合があります
  3. GC 含量：40～60% が最適です
  4. 避けるべき配列：
    • TTTT 配列（転写を終結させます）
    • 同じヌクレオチドが長く連続する配列（4 回を超える反復）
標的の位置：
  • ノックアウトの場合：初期のエクソン（遺伝子の最初の 50%）を標的にします
  • 活性化の場合：転写開始部位（TSS）から -200～+1 bp を標的にします
  • 阻害の場合：TSS から -50～+300 bp を標的にします
ベストプラクティス：
  • 標的遺伝子ごとに異なる sgRNA を 3～4 種類 テストします
  • 高い効率スコア（>0.5）で、オフターゲットが最小限の sgRNA を選択します
  • サンガーシーケンスで実験的に検証します

クイックスタートの例

例 1：ヒト細胞で TP53 をノックアウトする

ステップ 1：Addgene を確認する

df = pd.read_csv('addgene_grna_sequences.csv')
tp53_results = df[(df['Target_Gene'] == 'TP53') &
                  (df['Target_Species'] == 'H. sapiens') &
                  (df['Application'] == 'cut')]
# Result: Found 0 entries -> Proceed to Option 2

ステップ 2：CRISPick データセットをダウンロードする

# Download human GRCh38 SpCas9 knockout dataset
wget https://portals.broadinstitute.org/gppx/public/sgrna_design/api/downloads/\
sgRNA_design_9606_GRCh38_SpyoCas9_CRISPRko_RS3seq-Chen2013+RS3target_NCBI_20241104.txt.gz

gunzip sgRNA_design_9606_GRCh38_SpyoCas9_CRISPRko_*.txt.gz

ステップ 3：TP53 の sgRNA を抽出する

df = pd.read_csv('sgRNA_design_9606_GRCh38_SpyoCas9_CRISPRko_*.txt', sep='\t')
tp53 = df[df['Gene_Symbol'] == 'TP53']
top_sgrnas = tp53[
    (tp53['sgRNA_score'] > 0.6) &
    (tp53['Off_target_stringency'] > 0.5)
].sort_values('sgRNA_score', ascending=False).head(4)

print(top_sgrnas[['sgRNA_sequence', 'sgRNA_score', 'Exon_ID']])
例 2：ヒト iPSC で OCT4 を活性化する

ステップ 1：Addgene を確認する

oct4_results = df[(df['Target_Gene'] == 'OCT4') &
                  (df['Application'] == 'activate')]
# Found 1 validated sgRNA!
print(oct4_results['Target_Sequence'].values[0])
# Use this sequence

重要：まず検証済みの配列（オプション 1）を使用し、次に事前計算済みの設計（オプション 2）に進み、必要な場合に限って de novo 設計（オプション 3）を使用してください。予測スコアにかかわらず、遺伝子ごとに 3～4 種類の sgRNA をテストするのが標準的な方法です。

参考文献

コメント

Markdown 対応