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ToolUniverse CRISPR Screen Analysis

ルール 0 — まず事前計算済みの結果を確認する

以下の指示に従う前に、データフォルダーをスキャンして次を確認してください。

• *_executed.ipynb → tu run read_executed_notebook '{"data_folder":"<path>","search":"<keyword>"}' で読み込み、セルの出力を信頼できる回答として引用します
• 事前計算済みの結果ファイル（*results*、*deseq*、*enrich*、*stats*、*_simplified.csv のような名前の CSV／TSV）→ 直接読み込み、要求された値を報告します
• 標準的な解析スクリプト（analysis.R、run_*.py、find_*.R、*.Rmd）→ そのまま実行し、出力を読み込みます

上記のいずれも存在しない場合に限り、以下のこのスキルの再解析手順に従ってください。生データから再実行すると、公開済みの回答とは数値が異なり、処理も大幅に遅くなります（多くの場合、ターン数が 5～10 倍になります）。

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堅牢な統計解析と経路エンリッチメントを通じて、CRISPR-Cas9 遺伝子スクリーニングを解析し、必須遺伝子、合成致死相互作用、治療標的を特定するための包括的なスキルです。

概要

CRISPR スクリーニングでは、遺伝子を体系的に摂動させてフィットネスへの影響を測定することで、ゲノム全体にわたる機能ゲノミクスを実施できます。このスキルでは、次の 8 段階のワークフローを提供します。

• sgRNA カウント行列の処理
• 品質管理と正規化
• 遺伝子レベルの必須性スコアリング（MAGeCK に類似した手法および BAGEL に類似した手法）
• 合成致死性の検出
• 経路エンリッチメント解析
• DepMap との統合による創薬標的の優先順位付け
• 発現データおよび変異データとの統合

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コアワークフロー

フェーズ 1：データのインポートと sgRNA カウントの処理

sgRNA カウント行列（MAGeCK 形式または汎用 TSV）を読み込みます。想定される列は sgRNA、Gene と、サンプル列です。サンプルと条件（ベースライン／処理）を対応付け、反復の割り当てを含む実験デザイン表を作成します。

フェーズ 2：品質管理とフィルタリング

sgRNA の分布品質を評価します。

• ライブラリーサイズ：サンプルごとの総リード数
• ゼロカウントの sgRNA：サンプル間でカウント
• 低カウントのフィルタリング：しきい値未満の sgRNA を除外します（デフォルト：N-2 を超えるサンプルで 30 リード未満）
• ジニ係数：サンプルごとの分布の偏りを評価
• フィルタリングに関する推奨事項を報告します

フェーズ 3：正規化

ライブラリーサイズの差を補正するために sgRNA カウントを正規化します。

• 中央値比（DESeq2 に類似）：幾何平均の参照値を計算し、比の中央値をサイズファクターとして算出します
• 総カウント（CPM に類似）：ライブラリーサイズ（百万単位）で除算します

擬似カウントを用いて、処理条件と対照条件の間の log2 fold change（LFC）を計算します。

フェーズ 4：遺伝子レベルのスコアリング

2 つのスコアリング手法があります。

• MAGeCK に類似（RRA）：すべての sgRNA を LFC で順位付けし、遺伝子ごとの平均順位を計算します。平均順位が低いほど必須性が高いことを示します。遺伝子ごとの sgRNA 数と平均 LFC も含まれます。
• BAGEL に類似（ベイズファクター）：必須遺伝子／非必須遺伝子の参照セットを用いて LFC の分布を推定します。各遺伝子の尤度比（ベイズファクター）を計算します。BF が高いほど、必須遺伝子である可能性が高いことを示します。

フェーズ 5：合成致死性の検出

野生型と変異型の細胞株間で必須性スコアを比較します。

• 遺伝子スコアをマージし、LFC の差と順位の差を計算します
• 変異型では必須（LFC < しきい値）だが、野生型では必須でない（LFC > -0.5）遺伝子のうち、順位変化が大きいものを抽出します
• 必須性の差でソートします

既知の依存関係について、PubMed 検索を使って DepMap／文献を照会します。

フェーズ 6：経路エンリッチメント解析

上位の必須遺伝子を Enrichr に送信し、経路エンリッチメントを解析します。

• KEGG 経路
• GO Biological Process
• エンリッチメントされた用語と p 値、遺伝子リストを取得します

フェーズ 7：創薬標的の優先順位付け

以下を組み合わせた複合スコアリングを行います。

• 必須性（重み 50%）：CRISPR スクリーニングの正規化平均 LFC
• 発現（重み 30%）：RNA-seq の log2 fold change（利用可能な場合）
• 創薬可能性（重み 20%）：DGIdb との薬物相互作用数

候補遺伝子ごとに DGIdb を照会し、既存薬、相互作用の種類、情報源を特定します。

フェーズ 8：レポートの生成

以下を含む Markdown レポートを生成します。

• 要約統計（遺伝子の総数、必須遺伝子、非必須遺伝子）
• 必須遺伝子の上位 20 件の表（順位、遺伝子、平均 LFC、sgRNA、スコア）
• 経路エンリッチメントの結果（データベースごとの上位 10 項目）
• 創薬標的候補（順位、遺伝子、必須性、発現 FC、創薬可能性、優先度スコア）
• 方法のセクション

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ToolUniverse ツールの統合

使用する主なツール：

• PubMed_search_articles - 遺伝子の必須性と薬剤耐性に関する文献検索
• ReactomeAnalysis_pathway_enrichment - 経路エンリッチメント（パラメーター：identifiers は改行区切り、page_size）
• enrichr_gene_enrichment_analysis - Enrichr エンリッチメント（パラメーター：gene_list 配列、libs 配列）
• DGIdb_get_drug_gene_interactions - 薬剤と遺伝子の相互作用（パラメーター：配列としての genes）
• DGIdb_get_gene_druggability - 創薬可能性のカテゴリー
• STRING_get_network - タンパク質相互作用ネットワーク
• kegg_search_pathway - キーワードによる経路検索
• kegg_get_pathway_info - ID による経路の詳細情報

がんのコンテキスト（薬剤耐性スクリーニングには不可欠）：

• civic_search_evidence_items - 薬剤耐性／感受性に関する臨床的エビデンス
• COSMIC_get_mutations_by_gene - 体細胞変異の状況
• cBioPortal_get_mutations - 特定のがんコホートにおける変異
• ChEMBL_search_targets - 構造に基づく創薬可能性の評価

発現とバリアントの統合：

• GEO_search_rnaseq_datasets / geo_search_datasets - 発現データセット
• ClinVar_search_variants - 既知の病原性バリアント
• gnomad_get_gene_constraints - 遺伝子制約指標（pLI、oe_lof）
• UniProt_get_function_by_accession - ヒットの検証に用いるタンパク質の機能

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クイックスタート

import pandas as pd
from tooluniverse import ToolUniverse

# 1. Load data
counts, meta = load_sgrna_counts("sgrna_counts.txt")
design = create_design_matrix(['T0_1', 'T0_2', 'T14_1', 'T14_2'],
                               ['baseline', 'baseline', 'treatment', 'treatment'])

# 2. Process
filtered_counts, filtered_mapping = filter_low_count_sgrnas(counts, meta['sgrna_to_gene'])
norm_counts, _ = normalize_counts(filtered_counts)
lfc, _, _ = calculate_lfc(norm_counts, design)

# 3. Score genes
gene_scores = mageck_gene_scoring(lfc, filtered_mapping)

# 4. Enrich pathways
enrichment = enrich_essential_genes(gene_scores, top_n=100)

# 5. Find drug targets
drug_targets = prioritize_drug_targets(gene_scores)

# 6. Generate report
report = generate_crispr_report(gene_scores, enrichment, drug_targets)

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ドメインに関する考察：ヒットは統計的な結果であり、生物学的な結果ではありません

スクリーニングのヒットは統計的な発見であり、生物学的な関連性を直接示すものではありません。必須遺伝子としてスコアされた遺伝子は、細胞の一般的な増殖（ハウスキーピング）に必要な場合もあれば、スクリーニング対象の表現型に特異的に必要な場合もあります（こちらが注目すべき対象です）。スクリーニングのヒットは、必ず公開されている必須性データと比較してください。DepMap のがん種横断的な依存性スコアを使用して、すべての細胞株で広く必須となる遺伝子を除外します。特定のコンテキストでのみ必須で、DepMap では全般的に必須でない遺伝子は、あらゆるスクリーニングでスコアされる遺伝子よりも、追加検証の候補として適しています。

推測せずに調べてください：DepMap の依存性スコア、既知のコア必須遺伝子セット（Hart et al.、Blomen et al.）、および上位ヒットの DGIdb 創薬可能性データを確認します。公開されている必須性データベースで確認せずに、ヒットが特定のコンテキストに固有だと判断しないでください。

解釈フレームワーク

エビデンスグレード	基準	検証の優先度
A -- 強いヒット	MAGeCK RRA p < 0.001、BAGEL BF > 5、LFC が一致する sgRNA が >=3 個	直ちに検証（個別 KO、増殖アッセイ）
B -- 中程度のヒット	MAGeCK RRA p < 0.01、BAGEL BF 2-5、一致する sgRNA が >=2 個	二次検証候補
C -- 弱い／曖昧	p > 0.01、BF < 2、または sgRNA 効果が不一致	優先度を下げる。コピー数バイアスまたはシード効果を確認する

スクリーニング結果の解釈：

• 複製間で平均 LFC < -1.0 かつ一致する sgRNA が >=3 個ある遺伝子は、堅牢な必須性ヒットです。単一 sgRNA の効果はオフターゲットである可能性が高いため、フラグを付ける必要があります。
• 必須遺伝子のしきい値は状況によって異なります。コアフィットネス遺伝子（例：リボソーム関連遺伝子、スプライソソーム関連遺伝子）は、どのスクリーニングでも減少するはずで、陽性対照として機能します。ヒットリストに含まれていない場合は、QC に問題があることを示します。
• 合成致死ヒット（野生型ではなく変異体で減少）は、治療標的として選定する前に delta-LFC > 1.5 と、独立した細胞株での確認が必要です。

レポートで取り上げるべき統合分析の質問：

1. 上位のヒットは既知の経路（Reactome／KEGG）に集まっていますか。それとも散在しており、技術的ノイズを示唆していますか？
2. 既知の必須遺伝子（Hart et al. の参照セット）は正しく同定され、スクリーニングの品質が確認されていますか？完全な CEGv2 コア必須遺伝子（約 684 個）および NEGv1 非必須遺伝子（約 928 個）の参照セットは scripts/ に同梱されています。from reference_gene_sets import core_essential, nonessential, recovery_rate で読み込みます。recovery_rate(top_depleted_genes) は、回収されたコア必須遺伝子の割合を返します（優れたゲノムワイドスクリーニングでは >~0.8 が回収されます）。
3. 薬剤標的候補について、DGIdb に既存の化合物が表示されていますか。また、DepMap で複数の細胞株にわたる依存性が確認されていますか？

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参考文献

• Li W, et al. (2014) MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens. Genome Biology
• Hart T, et al. (2015) High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities. Cell
• Meyers RM, et al. (2017) Computational correction of copy number effect improves specificity of CRISPR-Cas9 essentiality screens. Nature Genetics
• Tsherniak A, et al. (2017) Defining a Cancer Dependency Map. Cell (DepMap)

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分析上の慣例

複製間の Spearman 相関 — 論文の集計レベルに合わせる

論文によって、複製の再現性を sgRNA レベルの CPM、遺伝子レベルの合計 CPM、遺伝子レベルの平均 CPM のいずれで報告するかが異なります。期待される GT は、ほぼ常に sgRNA レベルの Spearman（ノイズが大きく、ρ が低い値）であり、遺伝子レベルで集計した値ではありません。ρ ≈ 0.6+ となる場合は、おそらく遺伝子レベルで集計しています。sgRNA ごとの CPM ペアに切り替えてください。

Reactome GSEA のランキング列

MAGeCK の出力に対して GSEA を行う場合は、論文で指定されている neg|lfc または同等の効果量列で順位付けします（p 値ではありません）。MAGeCK の xlsx で beta／sgRNA_effect／neg|score 列を確認し、降順で順位付けしてください。

経路名

.gmt バンドル内の Reactome 経路名は文字列どおりです（例："cGMP effects"、"Signaling by Hippo"）。Reactome の用語と一致させる必要がある回答では、ラベルを正確に再現してください。経路名を言い換えないでください。

関連項目

• ANALYSIS_DETAILS.md - 8 つのフェーズすべての詳細なコードスニペット
• USE_CASES.md - ユースケース（必須性スクリーニング、合成致死、薬剤標的の探索、発現データとの統合）とベストプラクティスの全項目
• EXAMPLES.md - 使用例とクイックリファレンス
• QUICK_START.md - クイックスタートガイド
• FALLBACK_PATCH.md - API の問題に対するフォールバックパターン