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電子顕微鏡による構造解析

全解像度範囲の電子顕微鏡データを探索・解析するためのパイプラインです。3D 密度マップ（EMDB）から、フィッティング済みの原子モデル（PDB）、生のマイクログラフデータセット（EMPIAR）、クライオ電子線トモグラフィーのボリューム（CryoET Data Portal）までを対象とします。PDB と AlphaFold を通じて、EM データを構造生物学の情報に関連付けます。

基本方針：

1. 解像度を意識する -- マップの解像度を常に報告して解釈します。4Å 未満なら原子モデルの構築が可能で、4～8Å ならドメインのフィッティングが可能です。8Å を超える場合は形状レベルの解析になります。
2. モデルよりマップを優先する -- 密度マップは主要な実験データであり、フィッティング済みモデルはその解釈です。
3. 手法が重要 -- 単粒子解析、トモグラフィー、二次元結晶構造解析、らせん再構成には、それぞれ異なる長所と制約があります。
4. 生データの価値 -- EMPIAR の生データを使えば、新しいアルゴリズムで再処理できます。データの利用可能性を必ず記載します。
5. 構造を相互参照する -- EMDB のマップを PDB エントリーや AlphaFold の予測と関連付けて、情報を補完します。
6. 英語を優先したクエリ -- ツール呼び出しでは英語の用語を使います。

EM の解像度によって、観察できる対象が決まります。TEM では個々のタンパク質複合体（約2nm）を解像できます。クライオ電子顕微鏡では、大型複合体の準原子分解能（4Å 未満）を達成できます。SEM では表面形態がわかります。目的に合った EM の手法を選んでください。

推測せず、検索する

科学的事実に確信が持てない場合は、記憶から推論するのではなく、まずデータベースを検索してください。データベースで検証した回答は、推測よりも常に信頼できます。

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説明せず、計算する

解析に計算（統計、データ処理、スコアリング、エンリッチメント）が必要な場合は、Bash 経由で Python コードを書いて実行してください。実行する内容を説明するのではなく、実行して実際の結果を報告してください。ToolUniverse のツールでデータを取得し、Python（pandas、scipy、statsmodels、matplotlib）で解析してください。

使用する状況

よくある例：

• 「[タンパク質／複合体]のクライオ電子顕微鏡構造を探す」
• 「[対象]で利用できる EMDB マップは？」
• 「[構造]の生のマイクログラフデータを取得する」
• 「[細胞小器官／細胞種]のトモグラフィーデータセットを探す」
• 「[EMDB エントリー]の解像度は？」
• 「この EM マップを PDB モデルと相互参照する」
• 「[試料]のクライオ ET データセットを探す」

このスキルの対象外：X 線結晶構造解析または NMR の構造については、PDB 検索ツールを直接使用してください。タンパク質構造予測については、tooluniverse-protein-structure を使用してください。

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主要データベース

データベース	内容	主な用途
EMDB	3D EM 密度マップ（40K 件超）	処理済みマップ、解像度データ、フィッティング情報の検索
EMPIAR	生のマイクログラフ／傾斜系列データセット	再処理用の元画像データへのアクセス
CryoET Data Portal	クライオ電子線トモグラフィーデータ	トモグラフィーボリューム、細胞コンテキスト、in situ 構造
PDB (RCSB)	EM マップにフィッティングされた原子モデル	EM データから導出された構造モデル
AlphaFold	AI 予測タンパク質構造	EM の解像度が限られている場合の補完モデル

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ワークフローの概要

Phase 0: Query Parsing
  Identify target protein/complex, method preference, resolution needs
    |
Phase 1: Map & Image Search (EMDB)
  Find EM density maps, resolution, method, sample details
    |
Phase 2: Structure Fitting (EMDB + PDB)
  Identify fitted atomic models, fitting quality
    |
Phase 3: Raw Data Access (EMPIAR)
  Find raw micrographs, tilt series, particle stacks
    |
Phase 4: Tomography (CryoET Data Portal)
  Search cryo-ET datasets, reconstructed volumes
    |
Phase 5: Cross-Reference & Context (PDB + AlphaFold)
  Connect to atomic models, predicted structures, literature
    |
Phase 6: Report Synthesis
  Integrated EM data landscape for the target

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フェーズの詳細

フェーズ 0：クエリの解析

ユーザーのリクエストから、次の項目を特定します。

• 対象：タンパク質名、複合体名、または生物種
• 優先する手法：単粒子、トモグラフィー、micro-ED、らせん法
• 必要な解像度：原子モデル構築（4Å 未満）、ドメインのフィッティング（4～8Å）、形状解析（8Å 超）
• データの種類：処理済みマップ、生データ、フィッティング済みモデル、またはすべて

Phase 1: マップと画像の検索（EMDB）

目的：クエリに一致する EM 密度マップを見つけます。

ツール：

• EMDB_search_structures -- キーワード、生物種、分解能で EMDB を検索します
  • 入力：query（検索語）、任意の resolution_min、resolution_max、method、limit
  • 出力：EMDB ID、タイトル、分解能、手法、サンプルを含むエントリ
• EMDB_get_structure -- EMDB エントリの詳細を取得します
  • 入力：emdb_id（例：「EMD-1234」）
  • 出力：マップの詳細、分解能、サンプル、処理情報、引用文献
• EMDB_get_map_info -- マップ固有の情報（分解能、等高線、寸法）を取得します
  • 入力：emdb_id
• EMDB_get_sample_info -- サンプル調製の詳細を取得します
  • 入力：emdb_id

ワークフロー：

1. 対象のタンパク質／複合体を EMDB で検索します
2. 結果を分解能順（高い順）に並べ替えます
3. 上位のエントリについて、サンプル調製と処理を含む詳細を取得します
4. 使用された EM 手法（単粒子解析、トモグラフィー、らせん対称解析など）を記録します
5. 関連する PDB および EMPIAR アクセッションを記録します

分解能の解釈：

• < 2.5A：原子に近い分解能。側鎖が見えます
• 2.5-4.0A：原子分解能。主鎖と大きな側鎖を追跡できます
• 4.0-8.0A：ドメインレベル。二次構造要素が見えます

• 8.0A：形状レベル。全体的な構造のみ確認できます

Phase 2: 構造フィッティング（EMDB + PDB）

目的：EM マップにフィッティングされた原子モデルを見つけ、フィッティング品質を評価します。

ツール：

• EMDB_get_validation -- EMDB エントリのフィッティング／検証データを取得します
  • 入力：emdb_id
  • 出力：フィッティング済みの PDB モデル、フィッティング統計、検証スコア
• RCSBData_get_entry -- PDB エントリの詳細を取得します
  • 入力：entry_id（PDB ID）
  • 出力：構造の詳細、分解能、手法、引用文献
• RCSBAdvSearch_search_structures -- 高度な PDB 検索を行います
  • 入力：query（検索語）、任意の experimental_method、resolution_max、limit
  • 出力：条件に一致する PDB エントリ

ワークフロー：

1. Phase 1 で見つかった各 EMDB エントリについて、フィッティング済みの原子モデルがあるか確認します
2. フィッティング統計（利用可能な場合は相互相関、実空間 R 値）を取得します
3. 構造の詳細を確認するため、PDB エントリを取得します
4. モデルがフィッティングされていない場合は、名前で関連構造を PDB から検索します

フィッティング品質の指標：

• 相互相関係数が 0.7 を超える場合、妥当なフィッティングが示唆されます
• 独立してフィッティングされたモデルが複数あると、信頼性が高まります
• マップとモデルの FSC 整合性チェックにより、フィッティングの妥当性を確認できます

Phase 3: 生データへのアクセス（EMPIAR）

目的：再処理の可能性に備え、生のマイクログラフデータを特定します。

ツール：

• EMPIAR_search_entries -- EMPIAR アーカイブを検索します
  • 入力：query（検索語）、任意の limit
  • 出力：EMPIAR ID、タイトル、データ型、サイズを含むエントリ
• EMPIAR_get_entry -- エントリの詳細情報を取得します
  • 入力：empiar_id（例：「EMPIAR-10028」）
  • 出力：データの説明、ファイル形式、関連する EMDB エントリ、ダウンロードリンク

ワークフロー：

1. 対象に関連するエントリを EMPIAR で検索します
2. Phase 1 で見つかった EMDB エントリと相互参照します（多くの EMDB エントリは EMPIAR にリンクしています）
3. データ型（マイクログラフ、粒子スタック、傾斜系列、ゲイン参照データ）を記録します
4. データセットのサイズを記録します（数百 GB から TB に及ぶ場合があります）

EMPIAR のデータ型：

• マイクログラフ：生の検出器フレーム、または動き補正済み画像
• 粒子スタック：抽出された粒子画像
• 傾斜系列：異なる傾斜角度で撮影した連続画像（トモグラフィー用）
• 再構成ボリューム：トモグラフィー再構成による 3D ボリューム

Phase 4: トモグラフィー（CryoET Data Portal）

目的：細胞生物学および生体内構造生物学のためのクライオ電子トモグラフィーデータセットを見つけます。

ツール：

• CryoET_list_datasets -- CryoET Data Portal を検索します
  • 入力：query（検索語）、任意の organism、limit
  • 出力：ID、タイトル、生物種、サンプルの種類を含むデータセット
• CryoET_get_dataset -- データセットの詳細を取得します
  • 入力：dataset_id
  • 出力：サンプルの詳細、傾斜シリーズのパラメーター、トモグラム情報
• CryoET_list_runs -- 個々のトモグラフィーランを検索します
  • 入力：dataset_id または query、任意の limit
  • 出力：ランの詳細、傾斜パラメーター、ボクセル間隔

ワークフロー：

1. CryoET Data Portal で対象の生物種または構造を検索します
2. サンプル調製やイメージングのパラメーターを含むデータセットの詳細を取得します
3. 個々のランを調べて、傾斜シリーズの仕様を確認します
4. ボクセル間隔とトモグラムの寸法を記録します

トモグラフィーと単粒子解析の違い：トモグラフィーでは細胞内環境（生体内）が保たれますが、一般的に分解能は低くなります。単粒子解析ではより高い分解能が得られますが、精製サンプルが必要です。

Phase 5: 相互参照と背景情報

目的：EM データを構造生物学のより広い背景と結び付けます。

ツール：

• alphafold_get_prediction -- AlphaFold の予測構造を取得します
  • 入力：qualifier（UniProt アクセッション）
  • 出力：予測構造の座標、信頼度スコア（pLDDT）
• PubMed_search_articles -- EM 研究について記述した論文を検索します
  • 入力：query（検索語）、任意の limit
  • 出力：タイトル、要旨、PMID を含む論文

ワークフロー：

1. EM 構造があるタンパク質について、比較のために AlphaFold の予測を取得します
2. AlphaFold の信頼度が低い領域（pLDDT < 70）を記録します。こうした領域は柔軟で、EM では解像が難しい可能性があります
3. PubMed で、EM 研究の手法に関する論文や生物学的知見を検索します
4. 論文内の EMDB/PDB/EMPIAR アクセッションを相互参照します

Phase 6: 解釈と推奨

マップを列挙するだけでなく、目的に合った適切なマップをユーザーが選べるようにしてください。

判断基準：どのマップを使うべきか？

目的	最適な分解能	手法	優先基準
原子モデルの構築	< 3.5A	単粒子解析	PDB モデルがフィッティングされた、最も高分解能のマップ
薬剤結合部位の解析	< 3.0A	単粒子解析	結合ポケットの側鎖を解像できること
ドメイン構造の解析	4-8A	単粒子解析またはサブトモグラム平均化	ドメインのフィッティングが必要な大規模複合体
コンフォメーション状態の解析	< 4.5A	単粒子解析（複数クラス）	同じデータセットから複数のマップが登録されている項目を探します
細胞内環境の解析	15-40A	Cryo-ET	生体内配置を示すトモグラフィーデータセット
再処理	任意	任意	EMPIAR の生データが必要です。最近のデータセット（検出器の性能が向上しているため）を優先します

品質評価チェックリスト：

• 報告された分解能は「ゴールドスタンダード」の FSC 0.143 カットオフに基づいていますか？（古い登録項目の中には 0.5 カットオフを使用しているものがあり、分解能が実際より高く見積もられます）
• マップは適切にシャープ化されていますか？（過剰にシャープ化されたマップは見栄えが良くなる一方で、アーティファクトを含む可能性があります）
• フィッティング統計は利用できますか？（相互相関 > 0.7 であれば許容範囲です）
• 同じサンプルから複数のマップが得られていますか？（コンフォメーションの不均一性を示唆し、薬剤設計では重要です）

分解能の推移分析：複数のマップが異なる時期に得られている場合は、分解能の推移を記録します。分解能が 6A（2015年）から 2.8A（2023年）へ向上している場合、そのサンプルは最新の機器を用いた高分解能単粒子解析に適していることが示唆されます。

フェーズ 7：レポートの統合

調査結果を実用的なレポートにまとめます。

1. 対象の概要 -- タンパク質／複合体の識別情報、生物学的意義
2. EM マップの状況 -- 利用可能なマップとその分解能、手法、年
3. 最良の利用可能な構造 -- モデルがフィッティングされた最高分解能のマップと品質評価
4. 推奨事項 -- ユーザーの目的に適した具体的なマップ／モデルと、その理由
5. 生データの利用可能性 -- 再処理に使用できる EMPIAR データセットとデータセットサイズ
6. トモグラフィーデータ -- 利用可能な場合は細胞内コンテキストのデータセット
7. 構造的コンテキスト -- X 線／NMR／AlphaFold 構造との比較
8. 主要な論文 -- 手法に関する論文、生物学的発見
9. データの不足 -- 欠けているコンフォメーション状態、未解明領域、より高い分解能の必要性

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よくある解析パターン

パターン	説明	主なフェーズ
構造の探索	タンパク質に関するすべての EM データを探す	0, 1, 2, 5
再処理の準備	再解析用の生データを探す	0, 1, 3
トモグラフィーの調査	生体内の構造データを調べる	0, 4
分解能の比較	時間の経過に伴う分解能の向上を追跡する	0, 1, 2
マップとモデルの検証	フィッティングされた原子モデルの品質を評価する	0, 1, 2, 5

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エッジケースと代替手段

• EMDB エントリーがない場合：複合体の構造は X 線または NMR でしか得られていない可能性があります。メソッドフィルターを指定して RCSBAdvSearch_search_structures で PDB を検索してください
• PDB モデルのない EMDB エントリー：低分解能のマップではよくあります。この不足を明記し、近似モデリングには AlphaFold を提案してください
• EMPIAR データがない場合：生データの登録は比較的新しく、普遍的ではありません。EMDB の処理済みマップが唯一利用可能なデータの場合があります
• 大きな複合体：リボソームやウイルスなどは、数百件の EMDB エントリーがある場合があります。分解能フィルターを使って結果を絞り込んでください
• 光学顕微鏡／表現型スクリーニングに関する質問（EM ではない場合）：ユーザーが実際に公開済みの光学顕微鏡またはハイコンテントイメージングのデータを求めている場合（例：「遺伝子 X をノックダウンしたイメージング研究は？」「抗体で染色した HeLa 画像を探して」「化合物 Y でどのような表現型がスクリーニングされた？」）、この EM パイプラインは適用されません。代わりに Image Data Resource（IDR）の検索ツールを使用してください（以下を参照）。

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関連リソース：IDR（光学顕微鏡とハイコンテントスクリーニング）

IDR（Image Data Resource、https://idr.openmicroscopy.org）は、光学顕微鏡およびハイコンテントスクリーニングのデータを扱う代表的なリポジトリです。上記の EM データベースとは異なります。キュレーションされたメタデータを使い、約 140 件すべての研究から公開済みのイメージング研究や画像を検索できます。

• IDR_search_studies — 遺伝子／生物種／化合物／表現型に関連するスクリーニングやプロジェクトを検索します。該当するスクリーニングとプロジェクトを IDR コンテナ ID とともに返します。
  • 例：tu.run_tool("IDR_search_studies", {"key": "Gene Symbol", "value": "TP53"}) -> 12 件の研究（idr0043 Human Protein Atlas、idr0135 melanocytes、...）。
  • 例：tu.run_tool("IDR_search_studies", {"key": "Phenotype", "value": "spindly"}) -> 4 件の RhoGTPase スクリーニング（idr0028）。
• IDR_search_images — メタデータに一致する個々の画像を検索します。各画像について、IDR 画像 ID、Web クライアント URL、主要なキーと値のペア（遺伝子、細胞株、抗体、生物種）を返します。
• IDR_list_metadata_keys — 検索可能なキー（Gene Symbol、Organism、Compound Name、Cell Line、Phenotype、Antibody Name、Pathology、...）を確認します。
• IDR_list_values_for_key — キーに対応する値と画像数を列挙します（例：すべての生物種やスクリーニング対象の全化合物）。

注：値の照合では、保存されている大文字・小文字が区別されます（生物種には homo sapiens ではなく Homo sapiens を指定する必要があります）。有効な値は IDR_list_values_for_key で確認してください。返された IDR 研究コンテナからデータセットや画像をさらに調べるには、既存の IDR_get_study／IDR_get_study_datasets／IDR_list_dataset_images／IDR_get_image_map_annotations ツールを使用してください。

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制限事項

• マップの可視化には非対応：このスキルではメタデータと統計情報を取得できますが、3D レンダリングには対応していません。可視化には UCSF ChimeraX または IMOD を使用してください
• 再処理には非対応：生データの検索には対応していますが、cryo-EM データの実際の処理には専用ソフトウェア（RELION、cryoSPARC）が必要です
• 解像度は精度を示すものではありません：誤りのある処理で得られた 3A のマップは、適切に検証された 4A のマップより信頼性が低い場合があります。フィッティングの統計情報が重要です
• 登録の遅れ：構造が公開されてから EMDB に登録されるまで数か月かかる場合や、その逆の場合があります