tooluniverse-metabolomics-analysis

メタボロミクス解析

代謝物の同定から定量、統計解析、経路解釈、他のオミクス層との統合まで、メタボロミクスデータを包括的に解析します。

ドメインに関する考察

メタボロミクスの定量では、正規化が極めて重要です。総イオン電流（TIC）正規化はサンプル量のばらつきを補正し、全体的な存在量の変化に適しています。内部標準による正規化は、特定の代謝物濃度が重要となるターゲット解析で、より高い精度を得られます。ピークテーブルの欠損値は、真の不在ではなく、検出限界を下回るシグナルを反映している場合があります。そのため、ゼロとして扱うのではなく、補完するか、明示的に処理する必要があります。装置の測定実行間でバッチ効果を考慮しないことは、誤った差次的代謝物が生じるよくある原因です。

推測せず、必ず調べる

• 代謝物の同一性：Metabolite_search と Metabolite_get_info を使用して、名称、CID、HMDB IDを確認してください。m/zだけから同一性を推定しないでください。
• 経路への所属：KEGG、MetaCyc、またはReactomeのツールに問い合わせてください。記憶に基づいて経路を列挙しないでください。
• 疾患との関連：CTDから Metabolite_get_diseases を使って取得してください。データベースの根拠なしに、臨床的な関連性を推定しないでください。
• CVのしきい値とQC基準：このワークフローで定義された値（CV < 30%、ブランク比 > 3x）を適用してください。推測で変更しないでください。

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このスキルを使用する場面

トリガー：

• ユーザーがメタボロミクスデータ（LC-MS、GC-MS、NMR）を持っている
• 代謝物の存在量や濃度について質問している
• 差次的代謝物解析の依頼
• 代謝経路解析
• メタボロミクスを含むマルチオミクス統合
• 代謝バイオマーカーの探索
• フラックスバランス解析または代謝モデリング
• 代謝物と酵素の相関解析

質問の例：

1. 「このLC-MSメタボロミクスデータを解析して、差次的代謝物を特定してください」
2. 「条件間でどの代謝経路に異常がありますか？」
3. 「疾患の分類に使える代謝物バイオマーカーを特定してください」
4. 「代謝物レベルと酵素発現を相関させてください」
5. 「差次的代謝物の経路エンリッチメント解析を行ってください」
6. 「メタボロミクスデータをトランスクリプトミクスデータと統合してください」

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主な機能

機能	説明
データのインポート	LC-MS、GC-MS、NMR、ターゲット／ノンターゲットプラットフォーム
代謝物の同定	HMDB、KEGG、PubChem、スペクトルライブラリとの照合
品質管理	ピーク品質、ブランク差し引き、内部標準による正規化
正規化	確率的商法、総イオン電流、内部標準
統計解析	単変量および多変量解析（PCA、PLS-DA、OPLS-DA）
差次解析	有意な代謝物の変化を特定
経路エンリッチメント	KEGG、Reactome、BioCycによる代謝経路解析
代謝物と酵素の統合	発現データとの相関解析
フラックス解析	代謝フラックスバランス解析（FBA）
バイオマーカー探索	複数代謝物のシグネチャー

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ワークフローの概要

Input: Metabolomics Data (Peak Table or Spectra)
    |
    v
Phase 1: Data Import & Metabolite Identification
    |-- Load peak table or process raw spectra
    |-- Match features to HMDB, KEGG (accurate mass +/- 5 ppm)
    |-- Confidence scoring (Level 1-4)
    |
    v
Phase 2: Quality Control & Filtering
    |-- CV in QC samples (<30%)
    |-- Blank subtraction (sample/blank > 3)
    |-- Remove features with >50% missing
    |
    v
Phase 3: Normalization
    |-- Sample-wise: TIC, PQN, or internal standards
    |-- Transformation: log2, Pareto, or auto-scaling
    |-- Batch effect correction (if multi-batch)
    |
    v
Phase 4: Exploratory Analysis
    |-- PCA for sample clustering
    |-- PLS-DA for supervised separation
    |-- Outlier detection
    |
    v
Phase 5: Differential Analysis
    |-- t-test / ANOVA / Wilcoxon
    |-- Fold change + FDR correction
    |-- Volcano plots, heatmaps
    |
    v
Phase 6: Pathway Analysis
    |-- Metabolite set enrichment (MSEA)
    |-- KEGG/Reactome pathway mapping
    |-- Pathway topology (hub/bottleneck metabolites)
    |
    v
Phase 7: Multi-Omics Integration
    |-- Metabolite-enzyme Spearman correlation
    |-- Pathway-level concordance scoring
    |-- Metabolic flux inference
    |
    v
Phase 8: Generate Report
    |-- Summary statistics, differential metabolites
    |-- Pathway diagrams, biomarker panel

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フェーズの概要

フェーズ1：データのインポートと同定

ピークテーブル（CSV/TSV）を読み込むか、生スペクトル（mzML）を処理します。精密質量（+/- 5 ppm）を用いて特徴量をHMDBと照合します。信頼度レベルを割り当てます：L1（標準品との一致）、L2（MS/MS）、L3（質量のみ）、L4（未知）。

L2の信頼度を得るためのMS/MSスペクトルライブラリ照合（MassBank Europe）：特徴量の同一性が不明で、フラグメンテーションスペクトルのみがある場合は、質量だけから同一性を推測するのではなく、src/tooluniverse/data/massbank_tools.json の5つのツールを使用して、MassBank Europeのオープンアクセス参照スペクトルライブラリ（約139,000件のレコード）を検索してください（質量のみの照合は最大でもL3です。L2とするには、一致するMS/MSフラグメンテーションパターンが必要です）。

ツール	用途
MassBank_spectral_similarity_search	未知の ID を特定する基本ワークフローです。 クエリの MS/MS ピークリストを、カンマ区切りの mz;intensity ペア（例："163.0601;100,145.0495;60,127.0390;30"）として送信すると、コサイン類似度でスコア付けされ、順位付けされた候補アクセッションが返されます（スコアは [0,1]、1.0 はスペクトルが完全一致することを示します）。デフォルトのしきい値は 0.5 です。信頼度の高い一致だけに絞るには 0.8 以上に上げ、候補を広げるには 0.3 程度まで下げます。
MassBank_get_record_by_accession	候補アクセッション（ほかの 4 つのツールのいずれかから取得）を、化合物名、化学式、正確質量、SMILES/InChI、装置／取得パラメーター、CAS/CHEBI/KEGG/PubChem への相互参照を含む完全なレコードに解決します。
MassBank_search_by_compound	すでに推定されている化合物の名前（例："glucose"）から参照スペクトルを検索します。仮説の確認や、比較用の参照スペクトルの取得に役立ちます。de novo 識別には使用しません。
MassBank_search_by_formula	分子式（例："C6H12O6"）で絞り込む、同様の検索です。正確質量から分子式を推定できているものの、具体的な化合物／異性体がまだ不明な場合に使用します。
MassBank_search_records_advanced	AND 条件で組み合わせたフィルターを使って、多数の候補を絞り込みます。exact_mass+mass_tolerance、必須フラグメントの peaks 値、neutral_loss、ion_mode、ms_type、instrument_type、または SMILES/SMARTS による substructure マッチを指定できます。アクセッションのみが返されるため、それぞれを MassBank_get_record_by_accession で解決してください。

ライブ環境で検証済み（MassBank Europe API、tu test/tu run、5 つすべてのツール、11/11 の例が合格）："glucose" を実際に検索すると、グルコースとその生物学的誘導体（例：グルコース-6-リン酸、MSBNK-Antwerp_Univ-METOX_P100333_9EE2、化学式 C6H13O9P、質量 260.0297、CAS/CHEBI/KEGG/PUBCHEM/INCHIKEY への相互参照）のスペクトルが返されます。検索結果はクエリと完全一致する化合物に限られないため、ヒットを確定した一致として扱う前に、各候補の formula/mass を確認してください。これは tooluniverse-metabolomics の HMDB ベースの検索とは明確に異なります。化合物が不明でスペクトルしかない場合は MassBank を使用し、名前または ID がすでに推定されていて、代謝経路や生物学的背景を知りたい場合は tooluniverse-metabolomics/HMDB を使用してください。

2 つ目の MS/MS スペクトルライブラリ（GNPS）と、天然物の生合成分類：src/tooluniverse/data/gnps_tools.json の 4 つのツールは、MassBank の代替ではなく、姉妹的な参照ライブラリである GNPS（Global Natural Products Social Molecular Networking）を対象とします。どちらもオープンなコミュニティ主導の MS/MS ライブラリです。GNPS は独自のコミュニティと分子ネットワーキングによる投稿パイプラインの影響で、天然物や微生物／環境代謝物をより多く収録しています。一方、MassBank Europe の投稿者は標準物質を用いて測定する装置ラボに偏っています。実際には、一方に含まれない化合物がもう一方には含まれている可能性が十分にあります。そのため、正体不明の特徴量を特定する場合は、MassBank で見つからなかったことを決定的な証拠とみなさず、両方を確認する価値があります。

ツール	用途
GNPS_get_spectrum	USI（Universal Spectrum Identifier、形式は mzspec:GNPS:GNPS-LIBRARY:accession:CCMSLIB{id}。GNPS 固有の表記ではなく、リポジトリ間で使われるスペクトルアドレス指定の標準）を使って GNPS のリファレンススペクトルを取得します。プリカーサーの m/z／電荷、ピーク数、m/z の範囲、および強度上位 20 個のピークを返します。
GNPS_compare_spectra	2 つの USI を並べて比較し（それぞれのプリカーサー m/z とピーク数）、インタラクティブな視覚比較用の mirror_plot_url を取得します。提案されたマッチを確定する前に、視覚的に妥当性を確認する場合に使用します。
GNPS_get_library_record	分子ネットワーキングのヒットまたは GNPS_get_spectrum の USI から得た CCMSLIB アクセッションを、化合物の完全なアノテーション（名前、付加イオン、SMILES、InChI／InChIKey、装置、イオンモード、貢献した PI、およびライブラリへの収録情報）に解決します。GNPS における MassBank_get_record_by_accession に相当します。
GNPS_npclassifier_from_smiles	スペクトルマッチングではありません — その後に行う別のステップです。SMILES（例：GNPS_get_library_record、MassBank、または HMDB ですでに解決したもの）を受け取り、天然物の生合成分類を返します。返されるのは pathway（例：Alkaloids, Shikimates and Phenylpropanoids）、superclass、class（いずれも配列です。構造が複数のクラスに属する場合があり、たとえば morphine は Isoquinoline alkaloids と Morphinan alkaloids の両方を返します）、および is_glycoside フラグです。ライブラリ検索なしであらゆる SMILES を処理できるため、データベースのヒットではなく、第一原理に基づくフラグメント解釈から提案した構造にも役立ちます。構造が得られた、または提案されており、その天然物としての背景を知りたい場合に使用してください。未知のスペクトルを最初に特定するためのツールではありません。

実環境で検証済み（gnps2 経由の GNPS API、tu test／tu run、全 4 ツール、7 個の例すべて成功）：GNPS_get_library_record("CCMSLIB00005435737") は "Lovastatin M+H; Mevinolin annotated in standard" に解決され、完全な SMILES／InChI と、フラット化されたトップレベルフィールドに加えて、基になる GNPS レコードフィールド（Scan、Library_Class、task_id など）を含む annotations 配列を返します。GNPS_npclassifier_from_smiles は quercetin を Flavonols／Flavonoids／Shikimates and Phenylpropanoids に、morphine を上記の 2 クラス（Isoquinoline alkaloids と Morphinan alkaloids）に正しく分類しました。これにより、class に複数の項目が含まれることが正当であると確認できました。

フェーズ 2：品質管理

QC サンプルの CV を評価し（30% 超は除外）、ブランク比を算出し（ブランクの 3 倍超を維持）、欠損値が 50% を超える特徴量をフィルタリングします。内部標準の回収率を確認します（95～105% が許容範囲）。

フェーズ 3：正規化

3 つの方法を利用できます：TIC（シンプルですが、総量が同程度であることを前提とします）、PQN（大きな変化に対して頑健で、推奨されます）、内部標準（スパイク標準物質を使用する場合に最も正確です）。続けて log2 変換または Pareto スケーリングを行います。

フェーズ 4：探索的解析

PCA でサンプルのグループ分けとバッチ効果を明らかにします。PLS-DA では教師ありの分離を行います（モデル品質を示すため、R2 と Q2 を報告します）。外れ値にフラグを付けて調査します。

フェーズ 5：差次解析

Benjamini-Hochberg FDR 補正を適用した Welch の t 検定（2 群）または ANOVA（複数群）を使用します。有意性の閾値は、adj. p < 0.05 かつ |log2FC| > 1.0 です。

フェーズ 6：パスウェイ解析

差次的代謝物を KEGG 化合物 ID にマッピングします。パスウェイのエンリッチメントには MSEA を実行します。トポロジーを考慮します。パスウェイのハブ（次数／媒介中心性が高い）に位置する代謝物は、より大きな影響を持ちます。

フェーズ 7：マルチオミクス統合

代謝物濃度と酵素発現を相関させます（Spearman）。期待される関係は、基質と酵素の負の相関（消費）、生成物と酵素の正の相関（産生）です。代謝物と遺伝子の証拠を組み合わせて、パスウェイの調節異常をスコア化します。

フェーズ 8：レポート

完全な出力例については、report_template.md を参照してください。

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ToolUniverse との統合

スキル	用途	フェーズ
tooluniverse-gene-enrichment	経路エンリッチメント	フェーズ 6
tooluniverse-rnaseq-deseq2	統合に用いる酵素発現量	フェーズ 7
tooluniverse-proteomics-analysis	統合に用いるタンパク質量	フェーズ 7
tooluniverse-multi-omics-integration	包括的な統合	フェーズ 7

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定量的な最低要件

コンポーネント	要件
代謝物	同定済み代謝物が 50 個以上
反復	各条件で 3 回以上
QC	QC サンプルで CV < 30%、ブランク減算を実施
統計検定	FDR 補正を適用した t 検定または Wilcoxon 検定
経路解析	KEGG または Reactome を用いた MSEA
レポート	QC、差次的代謝物、経路、可視化

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制限事項

• 同定：多くの特徴量は未同定のままです（レベル 4）
• カバレッジ：すべての代謝物を検出できるわけではありません（手法によって異なります）
• 定量：相対存在量です（標準物質なしでは絶対定量できません）
• 異性体：構造異性体の識別は困難です
• イオン抑制：マトリックス効果が定量に影響する場合があります
• ダイナミックレンジ：ターゲット手法と比べて限定的です

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参考文献

手法：

• MetaboAnalyst：https://doi.org/10.1093/nar/gkab382
• XCMS：https://doi.org/10.1021/ac051437y
• MSEA：https://doi.org/10.1186/1471-2105-11-395

データベース：

• HMDB：https://hmdb.ca
• KEGG Compound：https://www.genome.jp/kegg/compound/
• Reactome：https://reactome.org

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参照ファイル

• code_examples.md - すべてのフェーズ（データ読み込み、QC、正規化、統計、経路解析）の Python コード
• report_template.md - レポート全体の例（LC-MS による疾患群と対照群の比較）