tooluniverse-molecular-cloning

分子クローニングのアセンブリ設計（Gibson と Golden Gate）

DNA 断片をつないでコンストラクトを作る方法を計画します。オーバーラップ（Gibson）またはType IIS オーバーハング（Golden Gate）を設計し、内部サイトや一意でない接合部に起因する失敗を防ぎます。

Step 0 — 方法を選ぶ

Gibson Assemblyを使う場合	Golden Gateを使う場合
断片が少なく、任意の位置に傷のない／シームレスな接合部を作りたい	多数のパーツ、標準化され再利用可能なパーツ（MoClo／モジュラー方式）、ワンポット反応
PCR で約 20～40 bp の相同性を追加できる	内部の BsaI／BbsI サイトを除去できる（ドメスティケーション）
一度限りのコンストラクト	コンビナトリアルライブラリ／反復アセンブリ

どちらも配列に依存しません（Gibson では接合部に傷が残らず、Golden Gate では 4 bp の融合痕が残ります）。一意な断片が 2～4 個の場合は、通常 Gibson が最も簡単です。ライブラリやパーツのツールキットには Golden Gate が適しています。

Step 1 — Gibson Assembly

tu run DNA_gibson_design '{"operation":"gibson_design",
  "fragments":["ATGGCG...GAGGAC","GAGGAC...GGCAAG","GGGCAAG...ATCCT"],
  "overlap_length":20}'

各断片について、left_overlap、right_overlap、with_overlaps（PCR プライマーに追加する相同領域で伸長した断片）を返します。これらを tooluniverse-primer-design に渡してください。

Gibson の設計ルール

• オーバーラップの長さは 15～40 bp（通常 20～25 bp）です。GC 含量の低い接合部では、より長くします。
• オーバーラップの Tm は約 48～65 °Cとし、接合部間でバランスを取ります。
• 断片の順序が重要です。アセンブリの順に断片を並べます。最後の断片が最初の断片と 3′ 末端でオーバーラップするのは、環状化する場合（ベクター）のみです。
• 接合部の反復配列や二次構造（ヘアピン、直接反復）を避けてください。誤アセンブリの原因になります。
• 接合部は一意にしてください。2 つの接合部が相同性を共有すると断片が入れ替わる可能性があるため、各オーバーラップが一意になるように再設計します。

Step 2 — Golden Gate Assembly

tu run DNA_golden_gate_design '{"operation":"golden_gate_design",
  "parts":["ATGGCG...AAGAAC","CTGAGC...CTGATC","GAGGAG...GTGGTG"],
  "enzyme":"BsaI"}'

parts_with_overhangs を返します。各パーツ固有の 4 bp の left_overhang／right_overhang と、Type IIS 認識サイトで挟まれた full_sequence が含まれます（例：BsaI GGTCTC(N1) … 自身のサイトの外側を切断し、4 bp の融合オーバーハングを残します）。

Golden Gate の設計ルール

• ドメスティケーションは必須です。 選択した酵素のサイト（BsaI GGTCTC、BbsI GAAGAC）がパーツの内部にあってはなりません。内部にあると切断されます。アセンブリ前にサイレント変異で内部サイトを除去し、すべてのパーツを確認してください。あまり一般的でない酵素について、記憶した認識サイトに頼ってはいけません。また、パーツ内部のサイトをサイレント変異で除去できず、代わりにアイソシゾマーが必要な場合も同様です。REBASE_get_enzyme（サイトとメチル化感受性）および REBASE_list_isoschizomers（同じサイトを切断する代替酵素）が信頼できる参照先です。
• オーバーハングは一意かつ非パリンドロームでなければなりません。 各 4 bp 融合サイトは他と異なり、自身の逆相補配列と一致してはいけません。一致すると接合部で誤ったライゲーションが起きます。このツールは一意で非パリンドロームのオーバーハングを割り当てます。変更せずに使用してください。
• GC 含量が高い、またはすべて AT のオーバーハングは避けてください。高忠実度のオーバーハングセット（例：Potapov 2018）は、最もクリーンにライゲーションします。
• 順序はオーバーハングで決まり、パーツを並べる順序ではありません。4 bp の接合部がアセンブリを定義します。

Step 3 — 注文前の QC

scripts/cloning_qc.py は、上記の問題についてパーツをスクリーニングします。内部 BsaI／BbsI サイト（Golden Gate）、オーバーハングの一意性／パリンドローム、および Gibson オーバーラップの GC 含量／長さを確認し、PASS／WARN を表示します。

Step 4 — 注意点（明記すること）

• 内部の Type IIS サイト（Golden Gate）：失敗の最大の原因です。すべてのパーツをドメスティケーションしてください。
• Gibson のオーバーラップが一意でない場合、または相同性を共有している場合：断片の入れ替わり／誤アセンブリが起きます。
• 接合部の反復配列や強い二次構造は、どちらの方法でも効率を低下させます。
• オーバーラップの Tm の不均衡（Gibson）：一部の接合部だけが形成され、他は形成されないことがあります。
• 断片の生成には、オーバーラップ／オーバーハングを付加したプライマーが引き続き必要です。tooluniverse-primer-design で設計と QC を行い、特異性を BLAST で確認してください。

逆向きに考える — 既存のアセンブリから何が生成されるか？

逆向きの質問（「これらのプラスミドを Esp3I を使った Golden Gate 反応で組み合わせた場合、生成物は何を発現するか／gRNA は何を標的にするか？」）には、1 回の呼び出しで回答できます。消化・ライゲーションのシミュレーターを手書きで作成しないでください。

tu run DNA_golden_gate_assemble '{"fragments":["<plasmid1>","<plasmid2>","<plasmid3>"],
    "enzyme":"Esp3I","labels":["pLAB-CTU","pLAB-gTU2E","pLAB-CH3"]}'

各入力を消化し、認識サイトが残る断片（反応中に再切断されるため、残存できません）を除外してから、4 bp のオーバーハングを照合して残りの断片を連結し、各接合部のオーバーハングを含む product_sequence、product_length、assembly_order を返します。circular: false を渡さない限り、入力は環状プラスミドとして扱われます。

次に、生成物にアノテーションを付けます。product_sequence 内の特徴（プロモーター、ORF、gRNA スペーサー）を特定します。gRNA カセットの場合、スペーサーはスキャフォールド（GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG）の直前、5′側にある約 20 nt の配列です。そのスペーサーをゲノムと照合して標的を特定し（BLAST_*、または Ensembl／NCBI／SGD の配列検索を使用）、隣接する PAM を確認します。構築物から推定される種に一致させてください。酵母の tRNA／Pol III パーツを使っているなら、ヒトではなく酵母のゲノムを検索します。

アセンブリで断片が連結されないと報告された場合は、各入力を DNA_virtual_digest（circular: true）で個別に消化し、何が放出されるかを確認してください。Golden Gate ドナーでは、挿入配列を挟んで Type IIS サイトが逆向きに配置されているため、正しく消化するとプラスミドごとに2 つの断片が得られます。1 つしか得られない場合、プラスミドにサイトがないのではなく、酵素名か circular の指定が誤っています。

酵素名：Esp3I と BsmBI は同じ酵素（CGTCTC）です。BsaI（GGTCTC）、BbsI（GAAGAC）、SapI（GCTCTTC）も認識されます。

正直な制限事項

• 消化とオーバーハング駆動のライゲーションは忠実にシミュレートされます（DNA_virtual_digest と DNA_golden_gate_assemble は、Type IIS 酵素がサイトの外側を切断する場合も含め、各酵素の実際のオフセットで両方の鎖を切断します）。モデル化されていないのは反応効率です。オーバーハングのライゲーションバイアス、不完全消化、誤っていても起こりうる接合部などは考慮されないため、返される生成物は意図されたアセンブリであり、収量の予測ではありません。アセンブルした構築物をシーケンシングして検証してください。
• ベクターバックボーンや ORF のフレームチェックは行われません。リーディングフレームとバックボーンの適合性はご自身で確認してください。

関連スキル

• tooluniverse-primer-design — 断片を作製するための PCR プライマー（相同性アーム／Type IIS テール付き）を設計します。
• tooluniverse-sequence-analysis — 入力配列を扱います。