tooluniverse-peptide-target-deorphanization

ペプチド標的のオーファン解除

ペプチドをオーファン解除します。ペプチドの配列と観察された表現型（および多くの場合、ペプチドが実際には結合しないと推測されている標的）を入力として、ToolUniverse のキー不要の特性解析、相同性、標的ファミリー、表現型、種間比較、および（任意の、キーが必要な）共フォールディングツールを使い、実際の標的として有力なタンパク質を特定します。

標的は GPCR に限らず、あらゆるものが対象です。 標的クラスルーター（GPCR リガンド／イオンチャネル毒素／プロテアーゼ標的／サイトカインまたは成長因子受容体／インテグリンリガンド／抗菌性／不明）が事前にペプチドを分類し、それに応じて候補列挙の戦略を調整します。GPCR は最も実績のあるケース（および検証済みの対照）ですが、パイプラインの中核である相同性、モチーフ、表現型、種間比較、共フォールドは標的クラスを問いません。また、ファミリーの列挙では **HGNC 遺伝子ファミリー（汎用）＋ InterPro（汎用）＋ GPCRdb（GPCR 専用の照合）**を使用します。

中核となる推論：推測せず、検索する

このスキルが防ごうとしている失敗は、ペプチドの名前や想定されている機序から標的を推測することです。ペプチドは表現型に作用していても、推測されている標的には結合しないことがあります。パラログ、別のファミリーメンバー、または結合界面が異なる別種の同じ受容体に作用している可能性があるためです。したがって、次の点に従ってください。

1. 記憶を頼りに標的を断定してはいけません。 すべての候補はツールの結果（相同性ヒット、ファミリーの列挙、表現型との関連、または構造共フォールド）に基づく必要があります。ツール名とアクセッションも記録してください。
2. ペプチドにまつわる定説ではなく、表現型 × 構造／配列の妥当性を根拠にしてください。 実際の標的は、（a）配列／モチーフ／構造から結合の可能性が示され、（b）表現型から生物学的な関連性が示されるものの共通部分です。「GLP-1 アナログだから GLP1R だ」という名前だけに基づく推測は、まさにオフターゲットの誤りにつながります。
3. 種間の違いを照合してください。 「種 A では結合するが、種 B では結合しない」場合、通常は標的が異なるのではなく、界面配列の多様化が原因です。ペプチドが「作用しない」と結論づける前に、必ずオルソログのセットを取得し、アッセイ対象種間で候補受容体のリガンド結合界面をアラインメントしてください。
4. 推測された標的に結合しないという結果は、行き止まりではなく手がかりです。 これにより、パラログおよび表現型が共通する受容体が候補リストの上位に移ります。

このスキルは、検証済みで、ほとんどがキー不要のツール（BLAST、ELM/PROSITE、GPCRdb/HGNC/GtoPdb、OpenTargets、EnsemblCompara/Alliance）を基盤としています。キーが必要な唯一の手順は、共フォールディングによる任意の構造確認（NVIDIA NIM）で、すでに絞り込まれた候補の順位付けにのみ使用します。

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自動化パイプライン（スクリプト）— 最短ルート

scripts/ にある実行可能な 2 つのスクリプトは、手作業で各フェーズをつなぐ必要なく、パイプライン全体を実行します。どちらも SDK 経由で ToolUniverse を読み込み、リポジトリのルートから実行します。

deorphanize_peptide.py — キー不要の候補生成と順位付け（フェーズ 1～4）

API キーは不要です。各ペプチドについて、特性を解析し（PepCalc/ProtParam）、非標準／環状残基にフラグを付け、PROSITE ＋ ELM のシグネチャをスキャンし、プロテアーゼ／分解のリスクにフラグを付け、標的クラス（GPCR／チャネル／プロテアーゼ／サイトカイン受容体／インテグリン／…）を分類して、それに応じた候補標的ファミリーを列挙します。さらに、表現型（OpenTargets）を根拠にし、上位候補については、オルソログのタンパク質配列を特定して、ヒト／アッセイ対象種／由来種間で結合界面をアラインメント（「種 A では結合するが、種 B では結合しない」という機序の確認）し、ClusPro で利用可能な PDB 構造を提案します。根拠のレベルを付した、順位付きの候補ショートリストを出力します。

python3 scripts/deorphanize_peptide.py \
  --sequence <PEPTIDE_SEQ> \             # OR  --fasta peptides.fasta  for BATCH mode
  --hypothesized-target <GENE> \         # optional; seeds family enumeration (e.g. GLP1R). OMIT for SEEDLESS mode
  --phenotype "<disease name>" \         # optional, REPEATABLE; OpenTargets anchor (use the DISEASE node, not a symptom) — pass several to union plausible phenotypes
  --assay-species mus_musculus \         # species of the NEGATIVE binding assay
  --source-species <organism> \          # optional; species where binding WAS observed -> 3-way interface alignment
  [--no-blast] [--out result.json]

モード：

• シードあり（--hypothesized-target GLP1R）— その遺伝子のファミリーを候補パネルとして列挙します（最もすっきりした方法です）。シードありでも、配列から導出される候補（以下参照）は必ず統合されるため、仮説のシードが間違っていても、実際の標的ファミリーを検索対象から外すことはありません。これがまさにデオーファナイゼーションの前提です。
• シードなし（省略）— PROSITE および BLAST 相同体のキーワードと標的クラスの名詞（例：receptor／channel／protease。ルーターが選択）を組み合わせ、UniProt 経由で候補標的を導出します。このリゾルバーが一時的に停止している場合は、表現型のみの検索に切り替わります。受容体だけに限定されなくなりました。
• 複数の表現型— --phenotype は繰り返し指定できます。考えられる疾患をすべて渡すと、アンカーはその和集合になります（標的ごとに最大スコアを採用）。適切な表現型を1つに絞れない場合に最適です。
• バッチ（--fasta）— FASTA の各エントリにつき1レコードを処理し、--phenotype／--assay-species を共有します。

常に報告される追加シグナル：

• 標的クラス— ルーターの判定（gpcr_ligand / ion_channel_toxin / protease_inhibitor_or_substrate / cytokine_or_growth_factor / integrin_ligand / guanylyl_cyclase_ligand / antimicrobial / unknown）と、判定の根拠となった情報、および選択されたシードなし検索用の名詞です。これにより、このスキルは GPCR だけでなく、幅広い標的に対応します。
• DPP4／プロテアーゼによる不安定性— ペプチドがアッセイで陰性となるのは、結合できないからではなく、切断されるからかもしれません。天然型 GLP-1（A@P2）はDPP4 感受性であり、エキセンジン-4（G@P2）は耐性です。不安定性フラグが立つと、「DPP4 阻害剤またはプロテアーゼ耐性アナログを使って再試験する」という注記が表示されます。これは「in vitro では作用するが、マウスのアッセイでは作用しない」ことに対する重要な別の説明です。
• ELM LIG モチーフ（希少度順）と、それぞれが結合する Pfam 結合ドメイン— PROSITE ファミリー名がないペプチドに対する、信頼度の低い補足情報です。
• 非標準／環状フラグ— 20種類の標準的な L-アミノ酸以外の残基があれば表示します。BLAST／PROSITE／ProtParam は標準的な直鎖ペプチドを暗黙に仮定しているため、非リボソームペプチドや環状ペプチド（単細胞生物の天然物によく見られます）を誤って特徴づけてしまうためです。このようなペプチドは Norine_get_peptide で名前から検索し、cofold_screen.py に --cyclic を渡してください。
• 種間の界面アラインメント（上位≤3候補）— 各候補について、ヒトとアッセイ対象種（任意で産生生物種も）のオルソログ配列を UniProt から取得し、アラインメント（EBI_msa_align）を行い、ペアごとの配列同一性（%）と置換数を報告します。ヒトとアッセイ対象種の配列同一性が低い場合、結合界面が最も異なっている可能性のあるオルソログを示します。これにより、「A では結合するが、B では結合しない」理由を機序的に説明できます。産生生物が UniProt に登録されていない原生生物の場合は insufficient と報告し、相手側の配列を手動で指定するよう案内します。
• ClusPro 対応 PDB（上位≤3候補）— PDBeSIFTS_get_best_structures で代表的な実験解明済み PDB ID を取得し、ClusPro_submit_peptide_docking にそのまま渡せます。

コントロールでの検証済み結果（--sequence HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS --hypothesized-target GLP1R --phenotype "type 2 diabetes mellitus"）：クラス B のパネル {GCGR, GHRHR, GIPR, GLP1R, GLP2R, SCTR} を復元し、**GLP1R を仮説標的（陰性と判定）**として示し、**GIPR をティア 1（ファミリー＋表現型、スコア 0.674）**に引き上げて、実際の標的の有力候補として提示します。これはまさにデオーファナイゼーションによる順位の付け直しであり、API キーなしで実行されます。

cofold_screen.py — 構造確認（Phase 5、キーが必要）

候補に絞り込んだ各受容体とペプチドをコフォールディングし、界面信頼度（ipTM）で順位付けします。NVIDIA_API_KEY が必要です。設定されていない場合はドライランを実行し、すべての受容体配列を解決（GPCRdb → UniProt のフォールバック）してコフォールディングの計画を出力するため、GPU 時間を使う前に入力を確認できます。

python3 scripts/cofold_screen.py --peptide <SEQ> --candidates GIPR GCGR GLP2R \
  [--backend boltz2|alphafold2_multimer|openfold3] [--assay-species mus_musculus] [--out cofold.json]

高速に実行するにはスクリプトを使ってください。単一のステップを手動で実行、デバッグ、または拡張する必要がある場合は、フェーズごとの詳細な手動リファレンス（スクリプトが自動化するすべてのツール呼び出し、正確なパラメーター名、注意点、フォールバックチェーン、実行時間に関する注記、完全な例を2つ掲載）は references/phases.md にあります。スクリプトのステップが失敗したとき、フェーズを手動で実行したいとき、またはパイプラインを新しいツールに対応させるときは、こちらをお読みください。

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パイプラインの概要

フェーズは6つあります。スクリプトはフェーズ1～4（およびPhase-5のドライラン）を自動化します。詳細、正確なツール呼び出し、注意点は references/phases.md に記載されています。フェーズを手動で実行する前にお読みください。

フェーズ	内容	主なツール
0 確認	すべてのツールが読み込まれることを確認し、フォールバックに切り替えます	tooluniverse.cli run …
1 特性評価＋モチーフ＋分類	物性、非標準／環状フラグ、PROSITE／ELM シグネチャ → リガンドファミリー、ターゲットクラスルーター（GPCR／チャネル／プロテアーゼ／サイトカイン／インテグリン／…）	PepCalc/ProtParam、ScanProsite→PROSITE_get_entry、ELM_*、ESMFold
2 候補生成	独立した4つのルート — 相同性、モチーフ→ドメイン、ターゲットファミリーの列挙（クラスを考慮）、表現型アンカー → 統合	BLAST/EBI_msa_align、HGNC+InterPro+GPCRdb+GtoPdb、OpenTargets
3 種間比較	「Aでは結合するがBでは結合しない」を解明：ヒト／アッセイ／由来種間でオルソログの界面をアラインメントします	EnsemblCompara、Alliance、UniProt、EBI_msa_align
4 絞り込み＋順位付け	配列 × 表現型 × 薬理学 × 種間比較に基づいてスコアを付け、候補を15件以下に絞り込みます	（交差判定ロジック）
5 構造確認 (任意、キーが必要)	上位候補をコフォールディングし、界面の ipTM で順位付けします。または、アカデミック利用無料の ClusPro ドッキングを使用します	NvidiaNIM_boltz2/…、ClusPro_submit_peptide_docking
6 レポート	根拠の段階とウェットラボ計画を含む、順位付けされた候補リスト	（インラインレポート）

コアとなる交差判定ルール： 実際のターゲットは、表現型として妥当（Route 2D）と配列／構造として妥当（Routes 2A～2C）が交差するところにあります。「GLP-1類似体だからGLP1Rだろう」という名前だけに基づく推測こそが、オフターゲットの誤りを招きます。ルートを統合して得られた候補にないターゲットを、決して断定しないでください。

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出力形式 — ランク付けされた候補リストレポート（インラインで返し、追加ファイルは作成しない）

1. ペプチドの特性評価 — 長さ、分子量、pI、GRAVY、不安定性、PROSITE/ELMシグネチャー、非標準／環状フラグ、フォールド信頼度（実行した場合）。
2. ランク付けされた候補テーブル — 候補標的ごとに1行：遺伝子＋アクセッション · 標的クラス · エビデンス階層 · 候補として浮上した経路 · OpenTargets 表現型スコア · 既知の薬理情報（GtoPdb のペプチドリガンド？） · 種間ステータス（ortholog_one2one？アッセイ種におけるインターフェースの配列同一性？）。
3. 種間の整合性に関する注記 — 最有力候補について、ヒトとアッセイ種（および由来種）のインターフェースを比較し、「Aには結合するがBには結合しない」ことから何が予測されるかを示します。
4. 推奨するウェットラボ検証 — 上位≤3候補とそのアッセイ種のオルソログを対象に、結合／競合試験とクラスに適した機能アッセイを実施します（GPCRにはcAMP／β-アレスチン、チャネルには電気生理学、プロテアーゼには酵素活性／阻害試験、サイトカイン受容体にはレポーターアッセイ）。GtoPdb に掲載されているファミリー拮抗薬がある場合は、対照として使用します。

エビデンス階層 — どのエビデンスがキー不要／検証済みで、どれがキー必須（コフォールド未実行）かを必ず明記します。また、読者が再ランキングを把握できるよう、当初仮説とした標的に対する否定的な候補があれば明示します。

• 階層1（強い）: 独立した配列／構造の経路が2つ以上あり、表現型アンカーに含まれ、さらに（フェーズ5を実行した場合）インターフェースのipTMが最上位である。
• 階層2（中程度）: 配列／構造の経路が1つあり、表現型による裏付けがある、または表現型による裏付けなしで配列経路が2つ以上ある。
• 階層3（弱い／仮説）: 単一経路のみ（深いパラログ、または配列／構造による裏付けのない表現型のみのヒット）。

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ペプチド生理活性プロパティデータベース（補足的な特性評価）

標的のデオーファナイゼーションそのものとは別に、ToolUniverse には単一の特性を扱う小規模なペプチドデータベースが7つあります。いずれもペプチドの標的を教えるものではなく、それぞれ「このペプチドは特性Xを持つか」という、より限定的な問いに答えるものです。ペプチドが候補に挙がった後の補足的なエビデンスとして役立ちます（たとえば、候補を推奨する前に溶血性／毒性もあるかを確認したり、安定性について主張する前に測定済みの半減期を確認したりできます）。実際に必要な特性に対応するデータベースを検索してください。すべてのペプチドについて7つすべてを検索するのは無駄です。

データベース	ツール	対象となる特性	検索フィールド
DBAASP	DBAASP_search_peptides, DBAASP_get_peptide	抗菌活性 — 標的ごとの MIC 値、末端修飾、構造	sequence、name、target_species、target_group、kingdom、uniprot、dbaasp_id
AMPSphere	AMPSphere_search_amps、AMPSphere_get_family、AMPSphere_get_amp_distributions、AMPSphere_get_amp_features	863K 以上の原核生物メタゲノム smORF から予測された抗菌ペプチド — ファミリークラスタリング、地理的／生態学的分布、物理化学的特性（MW、pI、電荷、モル吸光係数）	habitat、family、microbial_source、pep_length_interval、mw_interval、charge_interval、または特定の accession
ConoServer	ConoServer_search_conopeptides、ConoServer_get_conopeptide	イモガイ毒ペプチド（コノトキシン） — 配列、PTM、システインフレームワーク、遺伝子スーパーファミリー、薬理学的ファミリー	name、sequence、pharmacological_family、gene_superfamily、cysteine_framework、organism、または conoserver_id
Hemolytik 2.0	Hemolytik2_search_peptides	実験で検証された溶血性／毒性活性	dataType は {nature, source, seq} のいずれか、dataValue と組み合わせます — 名前による検索はできません。配列／部分文字列による検索には seq を使用します
CancerPPD 2.0	CancerPPD2_search_peptides	がんの種類／細胞株ごとの、実験で検証された抗がん活性	dataType は {cancer_type, cell_line, seq} のいずれか、dataValue と組み合わせます
TumorHoPe 2	TumorHope2_search_peptides	ドラッグデリバリーに使用される腫瘍指向性ペプチド	source、target_tumor、name_source、conjugate（すべて任意のフィルター）
PEPlife 2.0	PEPlife2_search_peptides	実験で測定された半減期／タンパク質分解安定性	dataType は {lin_cyc, org, seq} のいずれか、dataValue と組み合わせます — 名前による検索はできません。Hemolytik2 と同じパターンです

これらに依存する前に知っておくべき、実環境で確認された動作：

• Hemolytik2 と PEPlife2 はどちらも、固定された列挙値（それぞれ {nature, source, seq} と {lin_cyc, org, seq}）以外の name／dataType 値を拒否します。ここでペプチド名によるデータベース横断検索ができるのは、DBAASP、ConoServer、TumorHope2 の name_source のみです。名前しかない場合は、まず DBAASP／TumorHope2 を検索してください。配列がわかる場合は seq で検索してください。
• Hemolytik2／PEPlife2／CancerPPD2 の seq フィルターは、完全一致ではなく、部分文字列／断片の緩い一致です。よく知られたペプチドの完全な配列を検索しても、短い部分配列を共有する無関係なペプチドが返されることがあります。検索結果を該当ペプチドとして扱う前に、返された seq フィールドが実際に一致することを必ず確認してください。
• 執筆時点で、ConoServer_search_conopeptides は実環境で動作しないことが確認されました — 基盤となる一括 XML ダウンロード（conoserver.org/download/conoserver_protein.xml.gz）は毎回 HTTP 403 を返しました（tu test で 3/3 回。手動での再試行でも失敗）。同じ一括ファイルを読み込む ConoServer_get_conopeptide も、tu test のキャッシュ済み実行で一度成功した後、手動で再試行すると失敗しました。ConoServer は現在、信頼性に問題があります — 依存する前に低コストな呼び出しで稼働状況を確認し、403 が返された場合はコノペプチドのレコードを捏造しないでください。
• その他の 6 つのデータベース（DBAASP、AMPSphere、Hemolytik2、CancerPPD2、TumorHope2、PEPlife2）は、執筆時点で稼働しており、動作することが確認されました。

検証とテストセット

エキセンディン-4 → GLP1R のコントロールで検証済みです。クラスBのパネル {GCGR, GHRHR, GIPR, GLP1R, GLP2R, SCTR} を復元し、GLP1Rを（陰性の）仮説ターゲットとして特定し、GIPRをTier 1に昇格させます。これはAPIキーを一切使わずに実施した、デオーファナイゼーションによる再ランキングです。手順の全容（コントロールと「由来生物では結合するが、マウスでは結合しない」という実例）は references/phases.md にあります。

再現可能なテスト用プロンプトと検証可能なアサーションは evals/evals.json にあります（エキセンディン-4のコントロール、由来生物では陽性・マウスでは陰性のケース、非GPCRのシードなしケース）。スキルが引き続き期待どおりに動作するか確認するには、プロンプトを実行し、出力を該当するevalの assertions と照合してください。