tooluniverse-proteomics-analysis

プロテオミクス解析

ルール 0 — まず事前計算済みの結果を確認します

以下の指示に従う前に、データフォルダーをスキャンします。

• *_executed.ipynb → tu run read_executed_notebook '{"data_folder":"<path>","search":"<keyword>"}' で読み込み、セルの出力を信頼できる回答として引用します
• 事前計算済みの結果ファイル（*results*、*deseq*、*enrich*、*stats*、*_simplified.csv のような名前の CSV/TSV）→ 直接読み込み、求められた値を報告します
• 解析用の標準スクリプト（analysis.R、run_*.py、find_*.R、*.Rmd）→ そのまま実行し、出力を読み込みます

上記がいずれも存在しない場合に限り、以下のこのスキルによる再解析手順に従います。生データから再実行すると、公開済みの回答とは異なる数値が得られ、処理も大幅に遅くなります（ターン数が通常 5～10 倍になります）。

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質量分析ベースのプロテオミクスデータを、タンパク質の同定から定量、差次的発現、翻訳後修飾、システムレベルの解釈まで包括的に解析します。

このスキルを使用する場面

トリガー：ユーザーがプロテオミクスの MS 出力ファイルを持っている場合、タンパク質の存在量／発現、タンパク質の差次的発現、PTM 解析、タンパク質と RNA の相関、プロテオミクスを含むマルチオミクス統合、タンパク質複合体／相互作用解析、またはプロテオミクスバイオマーカーの探索について質問した場合。

説明ではなく計算を実行します

解析に計算（統計、データ処理、スコアリング、エンリッチメント）が必要な場合は、Bash 経由で Python コードを記述して実行します。何をするかを説明するだけでなく、実際に実行して結果を報告します。ToolUniverse ツールでデータを取得し、Python（pandas、scipy、statsmodels、matplotlib）で解析します。

主な機能

• データのインポート：MaxQuant、Spectronaut、DIA-NN、Proteome Discoverer、FragPipe の出力
• 品質管理：欠損値解析、強度分布、サンプルのクラスタリング
• 正規化：中央値、分位点、TMM、VSN — 実験デザインに応じて選択します（解釈フレームワークを参照）
• 補完：欠損値には MinProb（MNAR）、KNN（MAR）、QRILC を使用します
• 差次的発現：統計検定に Limma、DEP、MSstats を使用します
• PTM 解析：リン酸化部位の局在化、PTM エンリッチメント、キナーゼ予測
• タンパク質と RNA の統合：相関解析、翻訳効率
• 経路エンリッチメント：タンパク質セットに対する過剰代表解析と GSEA
• PPI 解析：STRING／IntAct を用いたタンパク質複合体の検出と相互作用ネットワークの解析

ワークフローの概要

Input: MS Proteomics Data
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Phase 1: Data Import & QC
Phase 2: Preprocessing (filter, impute, normalize)
Phase 3: Differential Expression Analysis
Phase 4: PTM Analysis (if applicable)
Phase 5: Functional Enrichment (GO, KEGG, Reactome)
Phase 6: Protein-Protein Interactions (STRING networks)
Phase 7: Multi-Omics Integration (optional, protein-RNA correlation)
Phase 8: Generate Report

各フェーズの詳細な手順については、PHASE_DETAILS.md を参照してください。

ToolUniverse との統合

スキル	用途	フェーズ
tooluniverse-gene-enrichment	経路エンリッチメント	フェーズ 5
tooluniverse-protein-interactions	PPI ネットワーク	フェーズ 6
tooluniverse-rnaseq-deseq2	統合用 RNA-seq	フェーズ 7
tooluniverse-multi-omics-integration	オミクス横断解析	フェーズ 7
tooluniverse-target-research	タンパク質アノテーション	フェーズ 8
tooluniverse-proteomics-data-retrieval	再解析する公開済みのがんプロテオミクス研究／定量マトリックス（PDC／CPTAC）を探す	フェーズ 1（入力）

正常組織における発現コンテキスト（ProteomicsDB）

src/tooluniverse/data/proteomicsdb_tools.json は、正常なヒト組織、細胞株、体液におけるMSベースのタンパク質発現を調べる5つのツールを提供します。Phase 8（レポート／解釈）でDEの結果を文脈化するのに役立ちます。つまり、このタンパク質は通常、組織特異的に発現するのか（DEヒットがより生物学的に注目される）、それとも広く発現するのか（DEヒットの特異性が低い）を確認できます。抗体ベースのHPA発現データ、およびPDCのがんコホート定量データ（tooluniverse-proteomics-data-retrieval）を補完します。

ツール	目的
ProteomicsDB_search_proteins	最初に遺伝子シンボル／名前を正しいUniProtアクセッションに解決します。広範なクエリ（例："EGFR"）では、名前や遺伝子名に部分文字列が一致する無関係なタンパク質が返されることがあります（実データで確認済み：「EGFR」を検索すると、実際のEGFRアイソフォームに加えてFLT1も返されました）。各ヒットのgene_nameを必ず確認してから、そのuniprot_idを使用してください
ProteomicsDB_get_protein_expression	UniProtアクセッションに対応する組織ごとの発現レコード全件。expression_value（log10正規化済みで、組織間比較が可能）とunnormalized_intensity（組織間で比較不可。このフィールドで順位付けしないでください）を提供します
ProteomicsDB_get_expression_summary	発現量順の上位N件の組織／細胞株と、組織／細胞株／体液の合計件数を返します。このタンパク質が「最も多く発現する場所」だけを知りたい場合の高速な方法です（実データで確認済み：EGFRの上位ヒットはすべて乳がん／食道がんの細胞株で、正常組織ではありません。ProteomicsDBでは多くのがん遺伝子について細胞株のデータが大半を占めるため、正常組織のベースラインが必要な場合はtissue_categoryを確認してください）
ProteomicsDB_list_tissues	フィルタリング前に、BTOオントロジーIDとともにすべての組織／細胞株／体液を列挙します
ProteomicsDB_get_peptides_for_protein	ペプチドレベルの同定エビデンス（配列、一意性、q値、出典となる実験／PubMed ID）を提供します。組織発現ツールでは得られない、同定レベルの裏付けです

レスポンスのラッパー：成功時、すべてのツールは{"status": "success", "data": {...}}を返します。確認済みのUniProtアクセッションをすでに持っている場合を除き、ProteomicsDB_get_protein_expression／_get_expression_summary／_get_peptides_for_proteinの前にProteomicsDB_search_proteinsを使用してください。

定量に関する最低基準

• 定量対象のタンパク質が少なくとも500個（ヒトでは3,000個以上が妥当、10,000個以上なら網羅性が高い）
• 各条件につき生物学的反復が少なくとも3つ（信頼できる統計解析に不可欠）
• 2つ以上のユニークペプチドを持つタンパク質に絞り込む（単一ペプチドで同定されたものはDEとして報告しない）
• 統計検定：Benjamini-Hochbergの多重検定補正を用いたlimmaまたはt検定
• 経路エンリッチメント：少なくとも1つの手法（GO、KEGG、またはReactome）
• レポートに含める項目：QCの概要、ボルケーノプロットを用いたDEの結果、経路解析、可視化

解釈の枠組み

出発点：実験デザイン

定量プロテオミクスでは、タンパク質量を比較します。推測せず、必ず調べてください。分析戦略を決める前に、実験手法、プラットフォーム、反復数を必ず確認してください。

定量戦略の判断フロー：

• 細胞培養で高い精度が必要 → SILAC（同一のMSラン内で比率を算出でき、最も高精度ですが、培養試料に限られます）
• 複数条件で多重化が必要 → TMT/iTRAQ（1回のランで最大18-plex。TMM/VSN正規化を使用します。観測されるフォールドチェンジを小さくする比率圧縮アーティファクトに注意してください）
• 探索研究で柔軟なデザインが必要 → Label-free（LFQ）（強度ベース。中央値／分位点正規化を使用します。欠損値が多く、ダイナミックレンジが広くなります）
• 反復：n < 3ではフォールドチェンジの信頼性が低くなります（分散を推定できません）。生物学的反復は最低3つ、臨床試料ではn >= 4が望ましいです。重複測定から有意性を報告しないでください。
• FDRカットオフ：Benjamini-Hochberg補正は必須です。FDR < 0.05が標準、FDR < 0.01は厳格な基準です。補正前のp値だけを報告しないでください。

タンパク質同定の推論

MS データからのタンパク質同定は、論理的な手順に沿って行います。推測せずに調べてください。タンパク質の注釈は、名前だけから機能を推測するのではなく、UniProt と STRING で検索してください。

1. ペプチドマスフィンガープリンティング（PMF）：インタクトタンパク質を消化し、測定したペプチド質量を、データベース内のすべてのタンパク質の理論上の消化物と比較します。一致と判断するには、4 個以上のペプチドがタンパク質配列の 15％以上をカバーする必要があります。単一ペプチドのヒットは信頼性が低くなります（複数のタンパク質に一致する可能性があります）。
2. タンデム MS（MS/MS）：フラグメントイオンスペクトルを検索エンジン（Andromeda、SEQUEST、X!Tandem）でペプチド配列に照合します。各ペプチドスペクトルマッチ（PSM）をスコアリングし、FDR 閾値を超える PSM のみをカウントします。一意なペプチド（1 つのタンパク質にのみマッピングされるペプチド）が不可欠です。共有ペプチドではタンパク質アイソフォームを区別できません。
3. タンパク質推定：複数のペプチドからタンパク質グループを推定します。相同タンパク質間でペプチドが共有されている場合は、個々のタンパク質ではなくタンパク質グループを報告してください。曖昧なタンパク質グループを解決するには、proteins_api_search または UniProt_search を使用してください。
4. カバレッジが重要です：信頼性の高いタンパク質同定には、一意なペプチドが 2 個以上必要です。一意なペプチド 1 個だけで同定されたタンパク質には、暫定的な結果であることを明記してください。

翻訳後修飾（PTM）分析の推論

PTM（リン酸化、ユビキチン化、アセチル化、糖鎖付加）は、タンパク質量だけでは捉えられない生物学的な複雑さをもたらします。

1. 部位の局在化：リン酸化部位を確信をもって局在化できるのは、局在確率が 0.75 より大きい場合（MaxQuant）、または ptmRS スコアが 75 より大きい場合（Proteome Discoverer）のみです。部位が曖昧な場合は、特定残基の修飾として報告しないでください。
2. 濃縮が必要です：リン酸化ペプチドの濃縮（TiO2、IMAC）を行わない場合、検出されるのは最も豊富なリン酸化ペプチドのみです（リン酸化プロテオームの約 1％）。濃縮していないデータでリン酸化部位が検出されなくても、生物学的に存在しないことを意味するわけではありません。
3. キナーゼ予測：リン酸化部位が同定された場合は、モチーフ解析を用いて上流のキナーゼを予測します。キナーゼと疾患の関連性を OpenTargets_get_target_safety_profile_by_ensemblID で照合してください。配列モチーフだけから推測せず、PhosphoSitePlus でキナーゼと基質の関係を調べてください。
4. 化学量論：特定の部位において、タンパク質のリン酸化率は 5％の場合も 95％の場合もあり、機能に非常に大きく影響しますが、測定は困難です。データが化学量論の推定を裏付けるのか、部位の同定だけを裏付けるのかを報告してください。

差次的発現の閾値

• 強い：padj < 0.01、FC > 2.0、一意なペプチド ≥5 個、欠損率 <20％
• 中程度：padj 0.01-0.05、FC 1.5-2.0、ペプチド 2-5 個、欠損率 20-50％
• 弱い／信頼性が低い：padj 0.05-0.1、FC 1.2-1.5、ペプチド 1-2 個（単一ペプチドのタンパク質は信頼性が低い）、欠損率 >50％（補完が必要）

エビデンスのグレード

• T1：直交する手法（ウエスタンブロット、PRM）と機能研究で検証済み
• T2：2 件以上の生物学的反復で有意な差次的発現（padj < 0.05、FC > 1.5）
• T3：1 件の実験で有意な差次的発現、または FC は低いものの有意
• T4：同定済みだが定量されていない、または単一ペプチドで同定

統合に関する質問

1. 差次的発現を示すタンパク質はいくつありますか？（差次的発現タンパク質が 500 個を超える場合は全体的な変化を示唆し、50 個未満の場合は標的を絞った効果を示唆します）
2. 主要な経路のタンパク質は一貫して制御されていますか？（複合体のすべてのサブユニットが変化している場合、確信度は高くなります）
3. プロテオミクスの結果はトランスクリプトミクスと相関していますか？（相関が低いことはよくあります。翻訳後制御が原因です）
4. PTM の変化が表現型を引き起こしていますか？（利用可能であれば、リン酸化プロテオミクスを確認してください）
5. 予想されるプロテオームに対するカバレッジはどの程度ですか？（ヒトでは、約 10K の定量が良好で、3K 未満は限定的です）

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制限事項

• プラットフォーム固有：MS ベースのプロテオミクス向けに最適化されており、ウェスタンブロットの定量には対応していません
• 欠損値：欠損率が高い場合（タンパク質あたり 50% 超）、統計的検出力が制限されます
• PTM 解析：包括的な PTM プロファイリングには濃縮プロトコルが必要です
• 絶対定量：相対存在量のみを測定します（TMT/SILAC を使用した場合を除く）
• タンパク質アイソフォーム：通常、遺伝子レベルに集約されます
• ダイナミックレンジ：MS のダイナミックレンジは mRNA シーケンシングと比べて限定的です

参考文献

手法：MaxQuant（doi:10.1038/nbt.1511）、プロテオミクス向け Limma（doi:10.1093/nar/gkv007）、DEP ワークフロー（doi:10.1038/nprot.2018.107）

データベース：STRING、PhosphoSitePlus、CORUM

参照ファイル

• PHASE_DETAILS.md - レポートテンプレートを含む、各解析フェーズの詳細な手順