tooluniverse-variant-functional-annotation

タンパク質バリアントの機能アノテーション

ProtVar の構造・機能コンテキスト、ClinVar の臨床分類、gnomAD の集団頻度、CADD の有害性スコア、ClinGen の遺伝子と疾患の妥当性を組み合わせた、タンパク質バリアントの包括的な機能アノテーションです。

tooluniverse-variant-interpretation との違い：このスキルはタンパク質レベルの機能的エビデンス、つまり構造マッピング、残基のコンテキスト、タンパク質ドメインへの影響、集団のアレル頻度に特化しています。完全な ACMG 分類や治療推奨は行いません。完全な ACMG 臨床分類には tooluniverse-variant-interpretation を使用してください。

推測せず、調べる

科学的事実に確信が持てない場合は、記憶に基づいて推論するのではなく、まずデータベース（PubMed、UniProt、ChEMBL、ClinVar など）を検索してください。データベースで検証した回答は、推測よりも常に信頼できます。

説明するだけでなく、計算する

分析に計算（統計、データ処理、スコアリング、エンリッチメント）が必要な場合は、Bash 経由で Python コードを作成して実行してください。何をするかを説明するだけでなく、実行して実際の結果を報告してください。ToolUniverse ツールでデータを取得し、その後 Python（pandas、scipy、statsmodels、matplotlib）で分析してください。

このスキルを使用する場面

使用条件：

• 「バリアント [GENE]:[protein_change] をアノテーションする」（例：「TP53:p.R175H」）
• 「[variant] の機能的影響は何ですか？」
• 「[HGVS または rsID] の ProtVar アノテーション」
• 「[variant] の集団頻度」
• 「[variant] は保存されたドメインにありますか？」
• 「[amino acid change] の構造的コンテキスト」

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病原性を判断するためのフレームワーク

バリアントの病原性を評価するには、4つの独立したエビデンスの側面から一貫した根拠を構築する必要があります。単一の指標だけでは不十分です。各側面で一致が見られるほど、確信度が高まります。

1. 保存性：その位置は進化的に制約されていますか？ その残基が脊椎動物またはすべての真核生物で維持されている場合、変異によって機能が損なわれる可能性があります。ProtVarの保存性スコアと、OpenCRAVATのGERP／PhastConsがこれを定量化します。ある位置の保存性が高いほど、特にミスセンスバリアントでは病原性の事前確率が高まります。保存性が低い場合、その位置は変異を許容すると考えられます。

2. 位置：機能的に重要な領域にありますか？ 注釈された活性部位または結合部位にあるバリアントは、頻度にかかわらず、機序上の影響を及ぼします。ドメインへの所属も重要です。転写因子のDNA結合ドメインにあるバリアントは、構造化されていないリンカーにあるものより懸念されます。ProtVarによる二次構造のコンテキスト（ヘリックス、シート、ループ）を加えると、より詳細に評価できます。ループ残基は一般に制約が弱いものです。翻訳後修飾部位（リン酸化、ユビキチン化）も重要な位置です。

3. 集団頻度：病原性を示すほど希少ですか？ 希少疾患の浸透率が高い病原性バリアントは、ほとんどの場合、集団データベースに存在しないか、非常に低頻度（gnomAD AF < 0.001）で見つかります。集団の1％に見られるバリアントが、重度の早期発症メンデル疾患を引き起こす可能性は低いと考えられます。最大集団AF（どの祖先集団で最も高いか）とホモ接合体数に注目してください。gnomADでホモ接合体が見つかる場合、劣性疾患で完全浸透を示す可能性は低くなります。

4. 計算予測：アルゴリズムの予測は一致していますか？ CADD PHRED ≥ 30は、予測上、最も有害な変化の上位0.1％にバリアントが位置することを示します。REVEL ≥ 0.75およびAlphaMissense ≥ 0.564は、病原性が高いという予測を示します。複数のツールの予測が一致すれば、計算予測のエビデンスに対する確信度が高まります。一致しない場合は、実験的エビデンスをより重視してください。CADD ≥ 20はACMG基準PP3を支持し、CADD < 10はBP4を支持します。

4つの側面を総合する：保存性が高く、活性部位に位置し、gnomADに存在せず、CADDとREVELで有害と予測されるバリアントは、ClinVarを確認する前でも強い病原性シグナルを示します。反対に、保存性の低い位置にあり、無秩序領域に位置し、集団の0.1％に見られ、良性と予測されるバリアントは、ClinVarの投稿者がかつてVUSに分類していたとしても、病原性である可能性は低いと考えられます。ClinVarの分類（特に専門家パネルによる複数星のエントリー）は計算予測より優先されます。ClinGenの遺伝子と疾患の関連性の妥当性は、その遺伝子のバリアントを解釈する際の背景となります。

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主な原則

1. まずProtVar — ProtVarはタンパク質レベルの情報を最も豊富に提供するため、必ずここから始めます
2. 表記の柔軟性 — HGVS（c.／p.）、ゲノム表記（chr:pos:ref:alt）、rsID、または遺伝子名＋AA変化を受け付けます
3. 集団頻度は必須 — 必ずgnomAD AFを報告し、祖先集団別の値にも言及します
4. ミスセンスには構造的なコンテキストが必須 — ドメイン、活性部位、保存性を確認します
5. レポート優先のアプローチ — 最初にレポートファイルを作成し、その後段階的に更新します
6. エビデンスのグレード付けは必須 — すべての主張をT1～T4で評価します

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エビデンスのグレード付け

• T1：3人以上の投稿者によるClinVarの病原性分類、またはClinGenによる確定的な遺伝子と疾患の関連性
• T2：1～2人の投稿者によるClinVarの病原性分類、CADD PHRED >25、引用された機能研究
• T3：計算予測（CADD 15～25、AlphaMissense、SIFT／PolyPhen）、ProtVarの構造フラグ
• T4：集団頻度の注釈のみ、ドメイン所属の注釈

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ワークフローの概要

Variant Input (HGVS / genomic / rsID / gene+protein_change)
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+-- PHASE 0: Variant Notation Normalization
|   Resolve to canonical HGVS and UniProt position; confirm gene/transcript
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+-- PHASE 1: ProtVar Protein-Level Annotation
|   map_variant -> structural coordinates, residue info, domain, active site
|   get_function -> conservation, functional impact prediction
|   get_population -> minor allele frequencies per ancestry
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+-- PHASE 2: Population Frequency (gnomAD)
|   gnomad_get_variant -> AF global + ancestry-specific; homozygote count
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+-- PHASE 3: Deleteriousness Scores (CADD)
|   CADD_get_variant_score -> PHRED score; raw C-score
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+-- PHASE 3b: Multi-Source Annotation (OpenCRAVAT)
|   OpenCRAVAT_annotate_variant -> 182+ annotators in one call
|   (ClinVar, gnomAD, SIFT, PolyPhen-2, REVEL, AlphaMissense, SpliceAI, etc.)
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+-- PHASE 4: Clinical Classification (ClinVar)
|   ClinVar_search_variants -> pathogenicity, review status, submitter count
|   ClinVar_get_variant_details -> full submission breakdown
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+-- PHASE 5: Gene-Disease Validity (ClinGen)
|   ClinGen_search_gene_validity -> evidence classification for gene-disease pair
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+-- SYNTHESIS: Integrated Annotation Report
    Structural context + population + deleteriousness + clinical + gene-disease

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フェーズ 0：バリアント表記の正規化

受け付ける入力形式：HGVS コーディング表記（NM_000546.6:c.524G>A）、HGVS タンパク質表記（NP_000537.3:p.Arg175His）、遺伝子＋タンパク質変化（TP53 R175H）、ゲノム表記（chr17:7674220:G:A hg38）、または rsID。ProtVar 用に省略表記を完全な3文字表記に展開します（例：「TP53 R175H」→「TP53 Arg175His」）。

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フェーズ 1a：1回の呼び出しによる包括的アノテーション（FAVOR）

バリアントが GRCh38 のゲノム座標で指定されている場合、FAVOR_annotate_variant(variant="chr-pos-ref-alt", e.g. "19-44908822-C-T") は、頻度（BRAVO/TOPMed、祖先集団別 gnomAD、1000G）、有害性（CADD、SIFT、PolyPhen、AlphaMissense）、保存性、ClinVar、調節領域のアノテーションを1回の呼び出しで返します。まずこれを使ってレポートの大部分の項目をすばやく埋め、その後、残基レベルの詳細や代替情報が必要な場合に ProtVar/gnomAD/CADD を調べます。GRCh38 のゲノム表記が必要です（タンパク質表記のみ、または rsID のみの入力は不可）。

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フェーズ 1：ProtVar によるタンパク質レベルのアノテーション

ProtVar_map_variant は hgvs、genomic（chr:pos:ref:alt）、または protein_variant（GENE pAA#AA）を受け取ります。少なくとも1つは必須です。結果から accession（UniProt ID）と position を抽出します。

ProtVar_get_function(accession, position) は、保存性スコア、ドメインへの所属、PTM 部位、機能的影響のアノテーションを返します。

ProtVar_get_population(accession, position) は colocated_variants を返します。これは、その位置で知られているアミノ酸変化ごとに1行を含み、結果、clinical_significance、集団の frequencies（gnomAD / ClinVar MAF）、SIFT/PolyPhen の predictions、関連する diseases を示します（例：P04637 の175番目には R175H、R175C、R175G などがあり、すべて Pathogenic）。

評価時の主要フィールド：active_site / binding_site フラグは優先度の高いシグナルです。conservation_score はこの位置の進化的制約を定量化します。domain への所属は、バリアントを生物学的な文脈に位置付けます。secondary_structure（ループ内のバリアントは通常、ヘリックスやシート内のバリアントより制約が弱いです）。

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フェーズ 2：集団頻度（gnomAD）

gnomad_get_variant は chrom-pos-ref-alt 形式（hg38、chr 接頭辞なし）の variant_id を受け取ります。必ず全体の AF、集団別 AF の最大値、ホモ接合体数を報告します。正確なバリアント ID が不明な場合は、代替として gnomad_search_variants を使用します。

gnomAD に存在しないことは注目に値しますが、それだけで病原性が確立されるわけではありません。

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フェーズ 3：有害性スコア（CADD）

CADD_get_variant_score は chrom（chr 接頭辞なし）、pos、ref、alt、genome（デフォルトは "GRCh38"）を受け取ります。CADD PHRED ≥ 30 は有害性が最も高い上位0.1％、≥ 20 は上位1〜10％です。CADD を利用できない場合は、代替として annotators="cadd_exome" を指定して OpenCRAVAT_annotate_variant を使用します。

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フェーズ 3b：複数ソースによるアノテーション（OpenCRAVAT）

OpenCRAVAT_annotate_variant は chrom、pos（1始まりの GRCh38）、ref_base、alt_base と、任意のカンマ区切りの annotators 文字列を受け取ります。chrom パラメーターは、接頭辞がない場合に chr を自動で追加します。

ミスセンスバリアントには、アノテーター "clinvar,gnomad3,sift,polyphen2,revel,alphamissense,cadd_exome" を使用します。スプライス領域のバリアントには "spliceai,dbscsnv" を追加します。非コードバリアントには "gerp,phastcons,dann" を追加します。

スコアが一致しない場合：REVEL が良性と判定し、CADD が有害と判定した場合は、ミスセンスバリアントについては REVEL をより重視します（REVEL はミスセンスに特化して学習されています）。複数のツールが一致する場合、シグナルの信頼性はより高くなります。レポートには、スコアの一致状況を記載してください。

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フェーズ 4：臨床分類（ClinVar）

ClinVar_search_variants(query="GENE protein_change") は、病原性分類とレビュー状況を返します。ClinVar_get_variant_details(variant_id) は、提出内容の詳細な内訳を提供します。

ClinVar のレビュー状況（星評価）：4 つ星 = 診療ガイドライン（最高の信頼度）、3 = 専門家パネルによるレビュー済み、2 = 複数の提出者による一致、1 = 単一の提出者、0 = 意見の相違あり、または未レビュー。単一の提出者による VUS 分類の重みは限定的です。専門家パネルによる分類は、計算予測よりも優先されます。

ClinVar を利用できない場合は、代替手段として OpenCRAVAT_annotate_variant を annotators="clinvar" とともに使用します。

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フェーズ 5：遺伝子と疾患の関連性（ClinGen）

ClinGen_search_gene_validity(gene_symbol, disease_label) は、キュレーション済みの遺伝子と疾患のエビデンス分類を返します。ClinGen の分類を強い順に並べると、Definitive → Strong → Moderate → Limited → Disputed → Refuted です。

重要な推論手順：遺伝子と疾患の関連性が Disputed または Refuted の場合、この遺伝子における ClinVar の病原性バリアントは、臨床的意義がバリアントレベルのエビデンスとは独立して不確実であるため、極めて慎重に解釈する必要があります。バリアントの病原性を解釈する前に、必ず ClinGen の分類を報告してください。

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統合：アノテーション統合レポート

# Variant Functional Annotation: [GENE] [VARIANT]
**Generated**: YYYY-MM-DD
**Input**: [original user input]
**Canonical notation**: [HGVS c. and p.]

## Executive Summary
(2-3 sentences: structural context, population frequency, pathogenicity signal)

## 1. Variant Identity
(Canonical HGVS, gene, transcript, consequence type, amino acid change)

## 2. Protein Structural Context [T3-T4]
(From ProtVar: domain, secondary structure, active/binding site, 3D coordinates)

## 3. Functional Annotations [T3]
(Conservation, predicted impact, PTM proximity, domain function)

## 4. Population Frequency [T4]
(gnomAD global AF, max population AF, homozygote count)

## 5. Deleteriousness Score [T3]
(CADD PHRED, REVEL, AlphaMissense — note concordance or discordance)

## 6. Clinical Classification [T1-T2]
(ClinVar significance, review stars, submitter count)

## 7. Gene-Disease Validity [T1]
(ClinGen classification for relevant disease)

## 8. Integrated Assessment
(Reasoning across all four dimensions: conservation, location, frequency, prediction)

## Data Gaps
(Any phase with no data; confidence caveats)

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フォールバックチェーン

• ProtVar_map_variant に失敗した場合 → ゲノム表記または protein_variant 形式で再試行します
• gnomad_get_variant に失敗した場合 → 遺伝子別に gnomad_search_variants を使用するか、OpenCRAVAT の gnomad3 アノテーターを使用します
• CADD_get_variant_score を利用できない場合 → OpenCRAVAT の cadd_exome アノテーターを使用します
• ClinVar_search_variants が空の結果を返した場合 → OpenCRAVAT の clinvar アノテーターを使用します
• ClinGen_search_gene_validity がデータを返さない場合 → 遺伝子と疾患の関連性は ClinGen によるキュレーション対象ではないことを記載します
• 個々のアノテーションツールがタイムアウトした場合、または GRCh38 の座標がある場合 → FAVOR_annotate_variant は、頻度 + CADD/SIFT/PolyPhen/AlphaMissense + 保存性 + ClinVar + 調節領域の情報を 1 回の呼び出しで返します

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制限事項

• ProtVar：UniProt の標準アイソフォームのみを対象とします。代替アイソフォームはマッピングされません
• gnomAD：gnomAD v4（エクソーム + ゲノム）に基づきます。ミトコンドリアバリアントの AF は別途扱われます
• CADD：計算予測のみです [T3]。実験的エビデンスに代わるものではありません
• ClinVar：提出者による解釈を反映します。星評価は正確性ではなく一致度を示します
• ProtVar の構造座標：実験構造が存在しない場合は、AlphaFold2 から導出されます