binding-characterization

结合表征：SPR 和 BLI

SPR 与 BLI 决策矩阵

因素	选择 SPR	选择 BLI
灵敏度	小分子、片段（<500 Da）	大型复合物、抗体
通量	低至中等（串行）	高（96 孔并行）
样品纯度	必须（否则会堵塞流路）	可耐受粗裂解液
动力学分辨率	更高（更适合快速动力学）	更低
传质	更敏感（可能扭曲 kon）	不太敏感
维护	高（流体系统）	低（蘸取读取）
样品消耗量	更高（连续流动）	更低
单次实验成本	芯片成本较低，运行成本较高	探针成本较高，运行成本较低

主要区别

SPR（表面等离子体共振）

• 机制：检测金表面的折射率变化
• 表面：带葡聚糖基质的金芯片（CM5、CM7 等）
• 流动方式：连续微流体
• 最适用场景：小分子、高亲和力、精确测量 kon/koff

BLI（生物层干涉）

• 机制：测量光学干涉图样的偏移
• 表面：光纤生物传感器探针（SA、Ni-NTA、AHC）
• 流动方式：蘸取读取（无微流体）
• 最适用场景：高通量、粗样品、抗体筛选

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故障排查：为什么 BLI 可行而 SPR 不行

原因	机制	解决方案
疏水性 CDR	吸附到 SPR 金／葡聚糖表面	添加 0.05% Tween-20，使用葡聚糖链更长的 CM7 芯片
聚集	在 SPR 流体系统中产生传质伪影	过滤样品（0.22μm），降低配体密度
稳定性差	在连续流动过程中降解	缩短周期时间，添加稳定剂（5% 海藻糖）
电荷不匹配	与带电葡聚糖发生非特异性结合	将缓冲液 pH 调整至比 pI 高或低 1，添加 1mg/mL BSA
解离缓慢	需要较长的再生时间（会损伤配体）	使用 BLI（一次性探针）

为什么 SPR 可行而 BLI 不行

原因	机制	解决方案
分析物较小	对于 <10 kDa 的分析物，BLI 灵敏度较低	使用适当的芯片进行 SPR 测量
亲和力较弱（KD >10μM）	在 BLI 蘸取过程中快速解离	提高分析物浓度
表达量低	信号不足	增加生物传感器的加载量

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传质注意事项

当分析物无法足够快地扩散至表面以维持平衡时，就会出现传质限制。这会扭曲动力学参数。

症状

• 观察到的 kon 看起来比真实 kon 慢
• 结合阶段呈线性（而非指数）
• kon 随配体密度变化
• Rmax 随流速变化

传质影响显著的情况

• 高亲和力相互作用（kon >10^6 M^-1s^-1）
• 配体密度高（>500 RU）
• 流速慢（SPR 中 <30 μL/min）
• 分析物较大（扩散缓慢）

缓解策略

策略	SPR	BLI
降低配体密度	高亲和力时 <200 RU	加载时偏移 <0.5 nm
提高流速	50-100 μL/min	提高振荡速度（1000 rpm）
使用定向固定	His-tag 捕获	生物素化配体
在拟合中纳入	传质模型（kt）	通常不太关键

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缓解非特异性结合

缓冲液添加剂（按效果排序）

添加剂	浓度	机制	最适用场景
BSA	0.5-1 mg/mL	阻断疏水位点	通用
Tween-20	0.02-0.05%	防止表面吸附	疏水性分析物
海藻糖	1-5%	稳定并阻断	不稳定蛋白质
蔗糖	5%	BLI 专用封闭剂	BLI 探针
羧甲基葡聚糖	1 mg/mL	竞争性封闭	带电蛋白质的 SPR 实验
NaCl	150-500 mM	减少离子相互作用	带电蛋白质

pH 优化

• 缓冲液 pH 与分析物 pI 至少相差 1 个单位
• pI 接近 7：使用 pH 6.0 或 8.0 的缓冲液
• 酸性蛋白（pI <5）：使用中性或碱性缓冲液
• 碱性蛋白（pI >9）：使用弱酸性缓冲液

参比扣除

始终包含：

• 空白参比通道（无配体）
• 仅含缓冲液的进样
• 非特异性结合对照

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再生条件

SPR 再生条件筛选（按顺序尝试）

条件	适用对象	注意事项
10 mM Glycine pH 2.0-2.5	大多数蛋白质-蛋白质相互作用	可能使配体变性
10 mM Glycine pH 1.5	强相互作用	条件苛刻，需限制暴露时间
1-2 M NaCl	离子相互作用	条件温和，优先尝试
10 mM NaOH	非常稳定的配体	可能水解蛋白质
10 mM Glycine pH 9-10	耐酸蛋白质	可能聚集
10 mM EDTA	His-tag、金属依赖型	会剥离 Ni-NTA
4 M MgCl2	疏水相互作用	检查配体稳定性

再生方案

1. 从最温和的条件（高盐）开始
2. 测试 30s 接触时间
3. 确认完全解离（回到基线）
4. 确认配体活性得以保留（重复结合）
5. 使用有效的最短接触时间

BLI 提示

• 探针通常为一次性用品（无需再生）
• 如需重复使用：条件与 SPR 相同，但暴露时间更短
• Anti-His 探针：10 mM Glycine pH 1.5，30s
• Streptavidin 探针：通常无法再生

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常见伪影及解决方案

双相结合

症状：结合或解离呈现两种速率 原因：

• 样品异质性（聚集体）
• 配体异质性（多种构象）
• 亲合效应（双价分析物）

解决方案：

• 过滤或离心样品
• 使用单价 Fab 片段
• 降低配体密度
• 使用异质模型拟合

负向解离

症状：解离阶段信号增加 原因：

• 配体从表面脱落
• 分析物在表面聚集
• 参比通道漂移

解决方案：

• 使用捕获抗体，而不是直接固定
• 提高缓冲液的严格度
• 改进参比扣除

钩状效应

症状：分析物浓度较高时信号下降 原因：

• 表面饱和并抑制再结合
• 空间拥挤效应

解决方案：

• 缩小分析物浓度范围
• 降低配体密度
• 使用更小的分析物片段

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动力学数据质量检查清单

分析前

• 已正确进行参比扣除
• 缓冲液进样显示平坦的基线
• 不同浓度下 Rmax 保持一致
• 结合期间无系统性漂移
• 完全再生（回到基线）
• 重复/三重复进样结果一致

拟合质量

• 残差随机分布（无系统性偏差）
• Chi² < Rmax 的 10%（或低信号时 < 1 RU²）
• kon 和 koff 误差 < 各自数值的 20%
• 动力学测得的 KD 与平衡 KD 一致（相差不超过 3 倍）
• 拟合的 Rmax 合理（接近理论值）

警示信号

• kon 接近质量传递极限（>10^7 M^-1s^-1），此时速率不可靠
• koff 快到无法采样（> 0.1 s^-1），或慢到无法在解离时间窗内测量（< 10^-5 s^-1）
• Rmax 远大于理论最大值（聚集或亲合效应）
• 动力学与平衡 KD 之间差异较大

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参考资料

平台比较

• BLI 与 SPR 比较 - Sartorius
• BLI 与 SPR - Nicoya

SPR 方案

• SPR 指南 - van der Merwe，Oxford
• SPR 实验指南 - Duke DHVI

故障排除

• 降低 SPR 中 NSB 的 4 种方法 - Nicoya
• 限制传质效应的 3 种方法 - Nicoya
• 抑制 BLI 中的 NSB - ACS Omega

再生

• SPR 再生 - SPRpages
• 掌握再生 - Nicoya

传质

• SPR 中的传质限制 - PMC
• 传质动力学 - SPRpages