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cell-free-expression

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关于 cell-free-expression

cell-free-expression 是用于设计和排查无细胞蛋白质合成（CFPS）的参考 Skill，面向研究人员。它通过系统对比、条件建议和操作方案，帮助选择表达体系并调整模板、折叠条件与试剂。

主要功能

  1. 01比较 CFPS 表达体系
  2. 02排查产量与蛋白质量问题
  3. 03优化密码子和 mRNA 模板
  4. 04规划二硫键形成条件
  5. 05改善溶解性与折叠

适用场景

  1. 01为目标蛋白选择表达体系
  2. 02诊断表达量低或无表达
  3. 03设计 E. coli CFPS 模板
  4. 04规划富含二硫键蛋白的条件

安装

复制下面的命令，在终端中运行。

$npx skills add https://github.com/adaptyvbio/protein-design-skills --skill cell-free-expression

安装后在 Claude Code 中输入/cell-free-expression确认已加载。

详细介绍

无细胞蛋白质合成（CFPS）

系统选择指南

系统最适用于产量翻译后修饰二硫键成本
E. coli extract快速原型设计、原核蛋白高（100-400 μg/mL）无较差（还原性环境）低
E. coli PURE条件明确、非天然氨基酸中（50-150 μg/mL）无可控高
小麦胚芽真核蛋白、膜蛋白高（100-500 μg/mL）有限中等中
兔网织红细胞哺乳动物蛋白、翻译后研究低（10-50 μg/mL）部分较差高
昆虫（Sf21）糖蛋白、复杂折叠蛋白中（50-100 μg/mL）糖基化良好高
HeLa/CHO天然哺乳动物蛋白低（10-50 μg/mL）完整的哺乳动物修饰良好很高

CFPS 故障排查矩阵

问题可能原因设计修正试剂修正
无表达N 端存在稀有密码子、RBS 不佳优化前 30 个密码子使用 BL21-CodonPlus 提取物
产量低mRNA 二级结构过强、模板问题优化 5' UTR（ΔG > -5 kcal/mol）增加 Mg²⁺（10-18 mM）、ATP
聚集蛋白质疏水、翻译过快添加增溶标签（MBP、SUMO）添加 0.1% Tween-20、分子伴侣
蛋白质无活性错误折叠、缺少辅因子减慢翻译（使用稀有密码子！）添加 GroEL/ES、DnaK/J
截短稀有密码子簇、mRNA 不稳定移除 AGG/AGA/CUA 簇补充稀有 tRNA
降解蛋白水解N 端 Met-Ala添加蛋白酶抑制剂

CFPS 密码子优化

E. coli CFPS 中应避免的密码子
密码子氨基酸问题tRNA 丰度
AGGArg非常稀有，导致停滞0.2%
AGAArg非常稀有，导致停滞0.4%
CUALeu丰度低0.4%
AUAIle稀有0.5%
CGAArg解码效率低0.6%
CCCPro可能导致停顿0.5%
GGAGly中等1.1%
设计规则
  1. 前 30 个密码子：最为关键，仅使用高频密码子
  2. 稀有密码子簇：避免在 10 nt 内出现 2 个或更多稀有密码子
  3. 稀有密码子占比：总体保持在编码序列的 5% 以下
  4. GC 含量：目标为 40-60%，以实现均衡表达
  5. 避免连续排列：G 或 C 残基连续不超过 6 个（二级结构）
  6. 策略性使用慢密码子：将稀有密码子置于结构域之间（有助于折叠！）
何时使用稀有密码子
  • 结构域边界（允许共翻译折叠）
  • 复杂结构元件之前
  • 蛋白质容易错误折叠时

mRNA 模板设计

5' UTR 优化
元件最佳设计影响
RBS（SD 序列）AGGAGG，距起始位点 7-9 nt核糖体结合
间隔SD 与 AUG 之间为 7 nt翻译起始
二级结构ΔG > -5 kcal/mol可及性
上游 AUG避免（会导致错误起始）减少截短
二级结构目标
区域理想 ΔG影响
AUG 周围 -30 至 +30> -5 kcal/mol翻译起始
完整 5' UTR> -10 kcal/mol核糖体加载
RBS 可及性未配对关键
模板格式
格式优点缺点
质粒稳定、产量高需要克隆
线性 PCR 产物快速、无需克隆可能需要稳定化处理
mRNA直接翻译不稳定、昂贵

二硫键形成

系统能力
系统原生二硫键支持能力所需添加剂
标准 E. coli 提取物较差（含有 DTT）IAM、PDI、GSSG/GSH
氧化型 E. coli 提取物良好预氧化谷胱甘肽
小麦胚芽中等降低 DTT 含量，添加 PDI
PURE 系统极少完整的氧化系统
昆虫/哺乳动物细胞良好微粒体膜
氧化折叠方案（E. coli 提取物）
1. Deplete DTT from extract (dialysis or treatment with IAM 5 mM)
2. Add oxidized/reduced glutathione: 4 mM GSSG, 1 mM GSH (4:1 ratio)
3. Add 10 μM PDI (protein disulfide isomerase)
4. Optional: Add 5 μM DsbC (disulfide isomerase)
5. Express at 25°C (not 37°C) for better folding
6. Incubation time: 4-6 hours
富含二硫键蛋白质的提示
  • 从小麦胚芽或氧化型提取物开始
  • 使用 PURE 系统进行精确控制
  • 考虑共表达 PDI/DsbC
  • 通过非还原 SDS-PAGE 验证

根据序列预测表达情况

特征良好一般差
稀有密码子含量<3%3-8%>10%
前 30 个密码子中的稀有密码子数01-2>2
GC 含量45-55%35-45% 或 55-65%<30% 或 >70%
5' UTR ΔG> -3 kcal/mol-3 至 -8< -10 kcal/mol
疏水片段连续 <5 个5-7 个连续 >8 个
N 端残基Met-Ala、Met-Ser、Met-GlyMet-Val、Met-ThrMet-Arg、Met-Lys
半胱氨酸对成对（偶数个）混合奇数个（游离巯基）

提高可溶性的策略

融合标签（按效果排序）
标签大小增溶效果切割方式备注
MBP40 kDa极佳TEV、Factor Xa综合效果最佳
SUMO11 kDa很好SUMO 蛋白酶切割后形成天然 N 端
NusA55 kDa极佳-尺寸较大
Trx12 kDa良好肠激酶适用于二硫键蛋白
GST26 kDa中等-二聚体
His₆1 kDa极少-主要用于纯化
提高可溶性的缓冲液添加剂
添加剂浓度作用机制
海藻糖50-100 mM化学伴侣
甘油5-10%减少疏水聚集
L-精氨酸50-100 mM抑制聚集
Tween-200.05-0.1%防止表面吸附
脯氨酸50 mM稳定渗透调节物
添加分子伴侣
分子伴侣系统目标问题浓度
GroEL/GroES一般性折叠1-2 μM
DnaK/DnaJ/GrpE易聚集各 1 μM
Trigger Factor新生链1-2 μM
ClpB聚集体再溶解0.5 μM

温度优化

温度适用情况权衡
37°C快速表达、稳定蛋白质聚集风险较高
30°C均衡（默认）良好的折中方案
25°C二硫键蛋白、复杂折叠速度较慢，折叠更好
18-20°C易聚集蛋白质速度慢很多，折叠效果最佳
16°C冷休克蛋白速度很慢，适用场景特殊

E. coli 提取物制备（关键变量）

变量影响最佳范围
收获时的细胞密度核糖体含量OD₆₀₀ 2.5-3.5
裂解方法提取物活性超声处理、珠磨
run-off 反应去除内源性 mRNA在 37°C 下进行 20-80 min
Mg²⁺ 浓度翻译准确性10-18 mM
K⁺ 浓度翻译速率150-200 mM
能量系统持续合成ATP/GTP、磷酸肌酸

PURE 系统的具体说明

优点
  • 成分明确（不含蛋白酶/核酸酶）
  • 线性 DNA 模板效果良好
  • 可掺入非天然氨基酸
  • 不同批次间具有可重复性
局限性
  • 不含分子伴侣（需另行添加）
  • 无翻译后修饰
  • 产量低于粗提取物
  • 成本较高
适合使用 PURE 的情况
  • 非天然氨基酸掺入
  • 研究翻译机制
  • 需要“干净”的蛋白质
  • 对蛋白酶敏感的目标
  • 线性模板表达

常见异常及解决方案

低分子量条带

原因：提前终止、蛋白水解、内部起始 解决方案：

  • 优化稀有密码子簇
  • 添加蛋白酶抑制剂
  • 检查是否存在内部 AUG 密码子
  • 使用 PURE 系统
高分子量条带

原因：终止不完全、读穿、聚集 解决方案：

  • 确保使用强终止密码子（优先使用 UAA）
  • 检查模板 3' 端
  • 添加释放因子（RF1/RF2）
  • 降低蛋白质浓度
无可溶性蛋白

原因：合成过程中发生聚集 解决方案：

  • 降低温度（25°C → 18°C）
  • 添加分子伴侣
  • 使用增溶标签
  • 优化翻译速率

参考资料

CFPS 概述
提取物制备
PURE 系统
小麦胚芽
密码子优化
二硫键形成
增溶标签
温度影响

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