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基因组变异解读

概述

这是一项推理技能。它编码了临床变异解读中使用的决策框架，帮助 Agent 正确分类基因组变异、说明每项证据的依据，并避免常见陷阱。它不会运行工具或生成代码。它假设用户已掌握变异层面的注释信息（HGVS 命名、群体频率、计算机模拟预测结果、ClinVar 记录、文献），并希望获得关于该变异含义的推理帮助。

主要有两套标准：

• ACMG/AMP 2015（Richards 等人，Genet Med）适用于孟德尔病的胚系变异，之后 ClinGen 序列变异解读（SVI）工作组对其进行了完善（例如，PVS1 决策树、PP3/BP4 定量校准、PM2_Supporting）。
• AMP/ASCO/CAP 2017（Li 等人，JMD）适用于癌症体细胞变异，按临床可操作性分级（I–IV），而非按致病性分级。

混淆这两套标准是最常见的解读错误。先选择框架，再应用。

用法

用户提出以下请求时，调用此技能：

• 使用 ACMG 或 AMP 规则分类某个特定变异（胚系或体细胞）。
• 判断某项 ACMG 标准（例如 PVS1、PM2、PP3）是否适用于当前变异。
• 调和相互冲突的证据（例如，ClinVar 标注为“可能致病”，但 gnomAD 频率较高）。
• 处理临床意义未明变异（VUS）——哪些证据会使其分类上调或下调。
• 负责任地解读计算机模拟预测评分（REVEL、CADD、SpliceAI、AlphaMissense）。
• 在将分类结果纳入临床报告前，对其草稿进行合理性检查。

调用后，按顺序逐步完成下文的决策框架部分。不得跳过基因-疾病有效性检查。应引用具体标准代码（例如，“由于在 gnomAD v4 中未检出且覆盖度良好，符合 PM2_Supporting”），而非使用含糊表述（“在人群中罕见”）。

响应格式

• 开头直接给出建议或分类（≤3 句话）
• 结构为：建议 → 依据（引用具体标准/阈值）→ 注意事项
• 使用表格进行比较；使用项目符号列出标准
• 省略用户已了解的背景信息——用户已经提出了问题
• 目标长度：200-400 词，除非用户要求详尽说明 此技能中的决策树和框架仅用于内部推理。运用它们得出结论，但不要在回复中复述。只提供最终建议及其支持证据。

核心概念

胚系变异的五级分类（ACMG/AMP 2015）

分级	临床含义
致病（P）	有充分证据表明该变异可导致疾病。应报告。
可能致病（LP）	致病性的确定程度 >90%。应报告，管理方式与致病变异类似。
意义未明（VUS）	证据不足或相互冲突。不可用于临床决策。 不得用于医疗管理。
可能良性（LB）	良性的确定程度 >90%。
良性（B）	有充分证据表明该变异不会导致疾病。

证据标准（共 28 项）

致病性证据按强度分级：极强（PVS）、强（PS）、中等（PM）、支持（PP）。良性证据分为：独立（BA）、强（BS）、支持（BP）。

致病性：

• PVS1 — 在功能缺失是已知致病机制的基因中出现无功能变异（无义、移码、经典 ±1/2 剪接位点、起始密码子、单外显子/多外显子缺失）。需遵循 ClinGen PVS1 决策树（见下文）。
• PS1 — 与先前确认的致病变异造成相同的氨基酸改变（核苷酸不同）。
• PS2 — 患者患有该疾病且无家族史，变异为新生变异（已确认父母亲子关系）。
• PS3 — 公认可靠的功能研究显示该变异具有有害影响。
• PS4 — 患者中的患病率显著高于对照组（例如，病例对照 OR >5）。
• PM1 — 位于突变热点和/或关键且公认的功能结构域内，且该区域没有良性变异。
• PM2 — 在人群数据库中未检出（或频率极低）。SVI 目前建议使用 PM2_Supporting，而非 Moderate。
• PM3 — 对于隐性遗传疾病，该变异与致病变异以反式检出。
• PM4 — 非重复区域中的框内插入缺失导致蛋白质长度改变，或出现终止密码子丢失。
• PM5 — 在某氨基酸残基处发现新的错义改变，而该残基处已有另一种错义改变被证实为致病性。
• PM6 — 假定为新生变异，但未确认父母亲子关系。
• PP1 — 在多个患病家族成员中与疾病共分离（共分离证据更强时可升级为 PS）。
• PP2 — 错义变异位于良性错义变异率较低且错义变异是常见致病机制的基因中。
• PP3 — 多项计算分析证据支持其有害影响（SVI：使用经校准的阈值，例如 REVEL）。
• PP4 — 患者表型高度符合病因单一的基因相关特征。
• PP5 — 可靠来源报告该变异为致病性（SVI 已弃用——请勿使用）。

良性：

• BA1 — 在大型非近交人群（例如 gnomAD）中的等位基因频率 >5%。
• BS1 — 等位基因频率高于该疾病的预期水平。
• BS2 — 在健康成人中检出，且剂量与该疾病的遗传方式不符（隐性疾病为纯合、X 连锁疾病为半合子、显性疾病为杂合）。
• BS3 — 公认可靠的功能研究显示该变异没有有害影响。
• BS4 — 患病家族成员中缺乏共分离。
• BP1 — 错义变异位于仅截短变异会导致疾病的基因中。
• BP2 — 与显性致病变异以反式检出，或与任何遗传方式的致病变异以顺式检出。
• BP3 — 在功能未知的重复区域中出现框内插入缺失。
• BP4 — 多项计算分析证据表明该变异没有影响（SVI：需经校准）。
• BP5 — 在具有其他分子病因的病例中发现该变异。
• BP6 — 可靠来源报告该变异为良性（SVI 已弃用）。
• BP7 — 同义变异，未预测会影响剪接，且不高度保守。

组合规则（ACMG/AMP 2015）

分类	所需证据组合
致病	(a) 1 项 PVS1 + ≥1 项 PS；或 (b) 1 项 PVS1 + ≥2 项 PM；或 (c) 1 项 PVS1 + 1 项 PM + 1 项 PP；或 (d) 1 项 PVS1 + ≥2 项 PP；或 (e) ≥2 项 PS；或 (f) 1 项 PS + ≥3 项 PM；或 (g) 1 项 PS + 2 项 PM + ≥2 项 PP；或 (h) 1 项 PS + ≥4 项 PP
可能致病	(a) 1 项 PVS1 + 1 项 PM；或 (b) 1 项 PS + 1–2 项 PM；或 (c) 1 项 PS + ≥2 项 PP；或 (d) ≥3 项 PM；或 (e) 2 项 PM + ≥2 项 PP；或 (f) 1 项 PM + ≥4 项 PP
良性	1 项 BA1；或 ≥2 项 BS
可能良性	1 项 BS + 1 项 BP；或 ≥2 项 BP
意义未明的变异（VUS）	不符合上述任何标准，或良性与致病证据相互冲突

此后，ClinGen SVI 引入了贝叶斯积分系统（Tavtigian et al., 2018），为每个证据强度等级设定积分值（PVS=8、PS=4、PM=2、PP=1；良性证据的积分值对称），并根据积分范围划分等级。调整标准强度时（例如 PM2_Supporting = 1 分），优先使用积分系统。

群体频率——筛选步骤

始终先应用频率筛选。这是成本最低、判定力最强的证据。

• BA1（独立支持良性）：在覆盖度和样本量足够（≥2000 个等位基因）的任一大洲人群中，等位基因频率**>5%**。部分 ClinGen VCEP 存在基因特异的 BA1 阈值（例如，MYH7 使用 0.1%）。
• BS1：频率高于根据疾病患病率、外显率、等位基因异质性和遗传异质性所预期的水平。使用过滤等位基因频率（FAF）——群体等位基因频率 95% 置信区间的上限——并与该疾病的最大可信群体等位基因频率进行比较。
• PM2_Supporting：在与疾病相关的人群中，变异在 gnomAD 中未检出或频率极低，且测序读段深度足够。覆盖度较差或变异位于低复杂度／节段重复区域时，不要应用 PM2——未检出可能是人为假象。

使用规模最大、最新的群体参考数据库（撰写本文时为 gnomAD v4）。适当排除创始人群体。切勿仅依赖 1000 Genomes。

计算预测工具——谨慎使用

除非 ClinGen 已针对特定基因校准，否则计算机预测分数至多只能作为支持性证据。

• REVEL（错义变异集成预测，0–1）：SVI 校准阈值大致为 >0.773 对应 PP3_Moderate，>0.644 对应 PP3_Supporting，<0.290 对应 BP4_Supporting，<0.183 对应 BP4_Moderate（具体数值因基因家族而异——请查阅当前的 SVI 建议）。
• CADD（所有变异类型，phred 标度）：>20 ≈ 排名前 1%，>25 ≈ 排名前 0.3%。该工具广受欢迎，但不建议单独用于临床分类——其错义变异校准效果较差。
• SpliceAI（0–1，改变剪接的概率）：≥0.2 表示可能有影响，≥0.5 表示很可能有影响，≥0.8 表示高置信度。有影响。适用于距剪接位点约 50 nt 以内的任何变异，包括同义变异和深部内含子变异。
• AlphaMissense：新兴工具；将其视为一种预测工具，不要赋予过高权重。

经验法则：

1. 切勿仅根据一种预测工具判定 PP3 或 BP4。至少使用两种结果一致的工具（剪接位点附近的错义变异使用 REVEL + SpliceAI；深部错义变异使用 REVEL + 保守性）。
2. 如果变异类型已由 PVS1 涵盖（无义变异、典型剪接变异），不要应用 PP3。这会造成重复计数。
3. 预测工具对符合读框的插入缺失变异和非编码变异的预测能力较弱——不要强行应用 PP3。

ClinVar — 如何解读

ClinVar 是一个提交数据库，并非事实标准。评估每项判定时，应考虑：

• 审查状态（星级）：

  • ★★★★ 实践指南（例如 ACMG SF 列表）
  • ★★★ 专家小组（ClinGen VCEP）
  • ★★ 多个提交者，意见无冲突
  • ★ 单个提交者，或解释存在冲突
  • （无星）未提供判定标准

  单星和无星条目本身并不可靠。如果某个商业实验室在没有支持证据的情况下将变异判定为致病，单凭这一点不足以应用 PS1 或影响分类。

• 日期：约 2016 年之前的分类早于 ACMG/AMP，可能已经过时。优先参考最新提交。

• 解释存在冲突：阅读每位提交者的证据，不要对判定取平均值。应回溯原始证据来解决冲突。

• 提交者身份：专家小组 > 大型参考实验室 > 小型实验室 > 病例报告。

ClinVar 适用于 PS1（相同氨基酸改变）、PM5（同一残基上的不同改变），也可用来查找原始文献。它不能替代你自行进行分类。

PVS1 决策树（ClinGen SVI 2018）

并非每个功能缺失（LoF）变异都应获得满强度的 PVS1。请按以下决策树逐步判断：

1. LoF 是否为该基因已知的致病机制？ 如果已报告的致病变异只有具有功能获得或显性负效应的错义变异，那么 LoF 可能不会致病。如果不明确，不要应用 PVS1——使用较低强度或不应用。
2. 变异类型：
   • 无义或移码：转至第 3 步。
   • 典型 ±1、2 剪接位点：转至第 4 步。
   • 起始密码子缺失：PVS1_Moderate（下游 ATG 可能挽救）。
   • 单外显子或多外显子缺失：考虑阅读框。
3. 该变异是否会导致无义介导的 mRNA 降解（NMD）？
   • 任意外显子（最后一个外显子除外）中的提前终止密码子（PTC），且位于最后一个外显子-外显子连接位点上游约 50 nt 以上 → 预计发生 NMD → 适用 PVS1。
   • 最后一个外显子中的 PTC，或倒数第二个外显子最后 50 nt 内的 PTC → 逃逸 NMD → 降级为 PVS1_Strong；还要检查被截短区域是否对蛋白功能至关重要。如果被移除区域在功能上并不关键，则进一步降级为 Moderate 或不应用。
4. 剪接变异：
   • 该变异是否可能导致外显子跳跃或内含子滞留？预测其对阅读框的影响。
   • 非关键外显子的框内跳跃 → PVS1_Moderate 或更低。
   • 导致 NMD 的移码跳跃 → PVS1。
5. 挽救转录本 / 替代亚型：如果受影响外显子仅存在于少量表达、且不在疾病相关组织中表达的亚型中，则降级。
6. 复发变异还是独特变异：如果同一外显子中已报告多个互不相关的致病 LoF 变异，则置信度会提高。

记录你应用了哪一步，以及所用强度。

变异类型 — 实用说明

• 无义和移码：通常应用 PVS1（按决策树判断后）。隐性遗传病还应考虑 PM2、PS4、PM3。
• 典型剪接位点（±1、±2）：按决策树判断后应用 PVS1。使用 SpliceAI 提供支持。
• 扩展剪接区域（±3 至 ±8、接近剪接位点的外显子区域、深部内含子）：不适用 PVS1。使用 SpliceAI 评估 PP3/BP4；如果 RNA 研究证实异常剪接，则使用 PS3。
• 错义——最难分类的一类：不能使用 PVS1。证据通常来自 PM1（热点 / 结构域）、PM2（稀有性）、PM5（同一残基上的另一种致病改变）、PP2（对错义变异不耐受的基因）、PP3（经过校准的预测工具）、PS1（相同氨基酸改变）、PS3（功能检测）。大多数变异最终会被归类为意义未明变异（VUS），因为没有任何一项证据足够有力。
• 框内插入缺失：如果不在重复区域中，则应用 PM4；如果在重复区域中且功能未知，则应用 BP3。预测工具的证据较弱——避免使用 PP3。
• 同义变异：通常应用 BP7，除非 SpliceAI 或保守性分析提示存在剪接影响。
• UTR、深部内含子、调控区：除非存在功能或剪接证据，否则默认归类为 VUS。

基因－疾病有效性——分类前先核实

对不导致相关疾病的基因中的变异应用 ACMG 标准，会得出看似确定、实则错误的结论。分类前：

1. 通过 ClinGen Gene-Disease Validity 确认该基因与患者表型相关（Definitive、Strong、Moderate、Limited、Disputed、Refuted、No Known Disease Relationship）。
2. Limited 或 Disputed → 不要在临床报告中报告致病性判定；该基因本身尚未得到验证。
3. 确认疾病机制（LoF、GoF、dominant-negative）——这会影响 PVS1、PP2、BP1 的适用性。
4. 确认遗传模式——这会影响 BS2、PM3 的适用性，以及对杂合与纯合观察结果的解读。

体细胞变异——采用不同框架

对于肿瘤来源的变异，请使用 AMP/ASCO/CAP 2017 分级，该分级评估的是癌症中的临床可操作性，而非生殖系致病性。不要对体细胞变异套用 ACMG 分级。

分级	含义
I — 临床意义强	FDA 批准的疗法、纳入专业指南的疗法，或有充分效能且达成共识的研究。A 级（FDA／指南）和 B 级（充分效能的研究）。
II — 可能具有临床意义	在另一种肿瘤类型中获 FDA 批准的疗法、有一定证据支持的研究性疗法，或多项小型研究。C 级和 D 级。
III — 临床意义未知	在群体数据库或癌症热点中未以显著等位基因频率观察到；没有令人信服的已发表证据表明其与癌症相关。
IV — 良性或可能良性	在群体数据库中以显著频率观察到；没有现有证据表明其与癌症相关。

使用 OncoKB、CIViC、COSMIC（热点）和 JAX CKB 等资源。区分驱动变异与乘客变异，并标记可能是肿瘤测序中偶然发现的生殖系变异（VAF 较高，约为 50%，且位于癌症易感基因中）——这类变异需要进行生殖系确认并按 ACMG 分类。

决策框架——逐个变异评估

按顺序执行以下步骤。得出分类后即停止。

1. 选择框架。 生殖系 → ACMG/AMP。体细胞 → AMP/ASCO/CAP。肿瘤－正常配对检测中偶然发现生殖系变异 → 两者都用。
2. 基因－疾病有效性。 查询 ClinGen。如果为 Disputed／Refuted，则将其分类为该疾病的良性变异，或不予分类。
3. 变异命名与转录本。 使用 MANE Select 或 ClinGen 批准的转录本。确认 HGVS 正确。
4. 群体频率。
   • AF >5% → BA1，分类为良性。停止。
   • AF > 该疾病的最大可信频率（BS1）→ 强良性证据。
   • 缺失／极罕见且覆盖度良好 → PM2_Supporting。
5. 变异类别与 PVS1。 如果预测为 LoF，按 PVS1 决策树评估并记录所用证据强度。
6. ClinVar 与文献。 检查星级、日期和冲突。提取 PS1、PM5 候选证据。将其作为查找原始数据的线索——不要使用 PP5／BP6。
7. 功能数据（PS3／BS3）。 仅使用与疾病机制相关且已充分确立的检测。若有 ClinGen VCEP 评分标准，则按检测质量确定证据权重。
8. 计算证据（PP3／BP4）。 使用经过校准的 REVEL／SpliceAI。不要与 PVS1 重复计入证据。
9. 共分离、新发变异、病例对照（PP1、PS2/PM6、PS4）。 应用 PS2 时，须确认父系／母系关系。
10. 反式／顺式观察结果（PM3、BP2）。 对隐性遗传病，应确认其与已知致病变异处于反式。
11. 表型特异性（PP4）。 仅在表型高度特异时使用（例如，生化模式对该基因具有特征性）。
12. 合并证据。 应用组合规则表或贝叶斯计分系统。明确列出所应用的每项标准及其证据强度。
13. 合理性检查。 最终判定是否符合证据叙述？如果致病性判定由单项证据驱动（例如，一条 ClinVar 星级为 1 星的提交记录），则降级为 VUS。
14. 记录。 记录每项标准、其证据强度、来源和审阅者。

不应使用此技能的情况

• 向患者出具临床报告（需要 CLIA 认证的实验室主任签字）
• 在无法获取功能数据或共分离研究的情况下重新分类变异
• 为个别患者制定药物基因组学剂量决策

何时应升级给人类专家处理

• 可操作基因中的 VUS，且治疗决策取决于其分类
• ClinVar 提交者之间的分类存在分歧（需要专家小组处理）
• 新变异需要先进行功能研究才能分类

常见错误

• 错误： 将变异归类为致病变异，但该基因的疾病有效性存在争议
  正确做法： 应用 ACMG 标准前，先检查 ClinGen 的基因—疾病有效性；如果有效性存在争议或更低，则跳过分类
  原因： 如果该基因不会导致这种疾病，那么其中的任何变异都不可能是该疾病的致病变异

• 错误： 不考虑 NMD 预测，对所有功能丧失变异一律采用完整的 PVS1 强度
  正确做法： 按照 PVS1 决策树逐步判断；若末端外显子中的无义变异逃逸 NMD，则应将其降级至 PVS1_Strong 或更低
  原因： 并非所有 LoF 变异都会触发 NMD；逃逸 NMD 的变异可能产生仍保留部分功能的截短蛋白

• 错误： 对经典剪接变异同时应用 PVS1 和 PP3
  正确做法： 如果 PVS1 已涵盖剪接效应，则不要再根据 SpliceAI 添加 PP3，因为这会对同一证据重复计数
  原因： 重复计数会抬高证据分数，可能导致变异被错误地归类为致病变异

• 错误： 对 gnomAD 中未出现的变异以中等强度应用 PM2
  正确做法： 几乎所有情况下都应按照当前 SVI 指南使用 PM2_Supporting
  原因： 中等强度的 PM2 会抬高分类结果；变异未出现在数据库中本身只是弱证据

• 错误： 将单个 ClinVar 一星提交视为足以证明致病性的证据
  正确做法： 阅读每位提交者提供的底层证据；单个实验室在没有支持数据的情况下给出的判断并不可靠
  原因： 一星条目缺少评审标准或独立确认；标签并不等同于证据

• 错误： 使用 PP5 或 BP6 标准（权威来源报告为致病／良性）
  正确做法： 直接评估原始证据；ClinGen SVI 已弃用 PP5 和 BP6
  原因： 这些标准在未核实推理过程的情况下，将分类工作外包给了其他实验室

• 错误： 仅依据单个计算机模拟预测工具来判定 PP3（例如，仅凭 CADD > 20）
  正确做法： 使用至少 2 个结果一致且经过校准的预测工具（例如 REVEL + SpliceAI）来判定 PP3
  原因： 单个预测工具的假阳性率较高；经过校准的工具结果一致，能提高可靠性

• 错误： 变异位于 gnomAD 覆盖较差的区域时仍应用 PM2
  正确做法： 检查变异位置的覆盖深度；在低覆盖区域（节段性重复、与假基因重叠）中未发现变异可能是技术假象
  原因： 该变异可能只是未被检出，而非确实不存在于人群中

• 错误： 使用 1000 Genomes 或 ExAC 作为主要人群频率来源
  正确做法： 使用当前规模最大的人群参考数据库（gnomAD v4 或更高版本）评估人群频率
  原因： 较旧的数据库样本量较小、涵盖的人群较少，且变异检测结果已过时

• 错误： 对相互矛盾的 ClinVar 分类取平均值（例如，“3 个实验室认为是 P，1 个认为是 LB → P”）
  正确做法： 独立阅读每位提交者提供的证据，并根据原始数据解决冲突
  原因： 对标签取平均值会忽略每项提交的质量和依据；证据充分的少数意见也可能正确

• 错误： 将 ACMG 致病性分级（P/LP/VUS/LB/B）应用于体细胞变异
  正确： 对体细胞变异使用 AMP/ASCO/CAP Tier I–IV 分级，该分级评估的是临床可操作性，而非生殖系致病性
  原因： 混用不同框架会导致报告令人困惑——体细胞变异评估的是治疗相关性，而非疾病致因

• 错误： 在肿瘤测序中发现癌症易感基因的高 VAF 变异（约 50%）时，未将其标记为潜在生殖系变异
  正确： 标记以进行生殖系确认，并单独进行 ACMG 分类——这会影响患者及其亲属
  原因： 生殖系发现需要遗传咨询和家系级联检测，而仅基于肿瘤的报告会漏掉这一点

• 错误： 将 VUS 报告为具有临床可操作性，或用其指导医疗管理
  正确： 明确说明 VUS 意味着证据不足，不应改变临床管理
  原因： 根据 VUS 采取行动会使患者接受不必要的干预，或产生虚假的安心

• 错误： 在未发现第二个致病变异的情况下，将杂合变异判定为常染色体隐性疾病的致病变异
  正确： 确认遗传模式；若要归因于隐性疾病，必须确认存在第二个反式致病变异
  原因： 隐性基因中的单个杂合变异无法解释患者的疾病

• 错误： 未依据基因层面的疾病机制证据，便默认应用 PP2 或 BP1
  正确： 确认错义变异（用于 PP2）或仅截短变异（用于 BP1）是否为特定基因已确立的疾病机制
  原因： 这些标准需要基因层面的证据；笼统应用会导致分类被不当地抬高或降低

• 错误： 将等位基因频率为 0.01% 的变异视为“未发现”，并应用 PM2
  正确： 使用过滤等位基因频率（FAF），并与该疾病的最高可信人群 AF 进行比较
  原因： 对于超罕见显性疾病，频率为 0.01% 的变异仍可能过于常见——“罕见”不等于“未发现”

• 错误： 随着新数据出现，仍保留旧的变异分类而不定期重新审查
  正确： 随着新的人群数据、功能研究和 ClinVar 提交结果不断出现，定期重新整理分类
  原因： 随着证据积累，分类会发生变化——先前的 VUS 可能已可分类，先前的 LP 也可能被降级

参考文献

• ACMG/AMP 2015：Richards 等，Genet Med 2015，https://doi.org/10.1038/gim.2015.30
• ClinGen SVI：https://clinicalgenome.org/working-groups/sequence-variant-interpretation/
• PVS1 决策树：Abou Tayoun 等，Hum Mutat 2018，https://doi.org/10.1002/humu.23626
• 贝叶斯 ACMG：Tavtigian 等，Hum Mutat 2018，https://doi.org/10.1002/humu.23388
• gnomAD：Karczewski 等，Nature 2020，https://doi.org/10.1038/s41586-020-2308-7
• ClinVar：Landrum 等，Nucleic Acids Res 2018，https://doi.org/10.1093/nar/gkx1153