protein-qc

蛋白质设计质量控制

关键局限

单项指标对结合的预测能力较弱。研究表明：

• 单项指标 ROC AUC：0.64-0.66（仅略优于随机）
• 指标是预筛选过滤条件，而非亲和力预测指标
• 组合评分对于有意义的排序至关重要

这些阈值可以筛除较差的设计，但不能预测结合亲和力。

QC 组织方式

QC 按用途和层级组织：

用途	评估内容	关键指标
结合	界面质量、结合几何结构	ipTM、PAE、SC、dG、dSASA
表达	可制造性、溶解度	不稳定性、GRAVY、pI、半胱氨酸
结构	折叠置信度、一致性	pLDDT、pTM、scRMSD

每个类别分为两个层级：

• 指标层级：计算所得数值及阈值（pLDDT > 0.85）
• 设计层级：模式／基序检测（奇数个半胱氨酸、NG 位点）

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快速参考：所有阈值

类别	指标	标准	严格	来源
结构	pLDDT	> 0.85	> 0.90	AF2/Chai/Boltz
	pTM	> 0.70	> 0.80	AF2/Chai/Boltz
	scRMSD	< 2.0 Å	< 1.5 Å	设计与预测
结合	ipSAE_min	> 0.61	> 0.70	AF3/Boltz（参见 ipsae）
	ipTM	> 0.50	> 0.60	AF2/Chai/Boltz
	PAE_interaction	< 12 Å	< 10 Å	AF2/Chai/Boltz
	形状互补度（SC）	> 0.50	> 0.62	PyRosetta
	interface_dG	< -10	< -15	PyRosetta
	界面 BUNS	<= 4	<= 2	PyRosetta
表达	不稳定性	< 40	< 30	BioPython
	GRAVY	< 0.4	< 0.2	BioPython
	ESM2 PLL	> 0.0	> 0.2	ESM2
	折叠 ΔG	< -2 kcal/mol	< -4 kcal/mol	SaProtΔG

设计层级检查（表达）

模式	风险	操作
奇数个半胱氨酸	未配对的二硫键	重新设计
NG/NS/NT 基序	脱酰胺	标记／避免
连续 >= 3 个 K/R	蛋白水解	标记
连续 >= 6 个疏水残基	聚集	重新设计

参见：references/binding-qc.md、references/expression-qc.md、references/structural-qc.md

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界面指标（PyRosetta）

除了形状互补度和 interface_dG 外，两项界面指标还能检测常见的从头设计失败模式：

• 埋藏但未满足的氢键（BUNS）：埋藏的极性原子未形成氢键。 这是主要的能量学失败模式，与 dG 和 dSASA 正交。界面 BUNS 应保持在 4 以下或等于 4（标准），或 2 以下或等于 2（严格）。
• ContactMolecularSurface：按形状互补度加权的接触面积，与 dSASA 不同，它不会被存在间隙或孔洞的界面误导。数值越高越好。

这两项指标均包含在 Cao 2022、AlphaProteo 和 BindCraft 的过滤条件中。

在结构质量排序方面，biomodals 还提供 modal_af2rank.py（AF2Rank），用于评估设计以自身结构作为模板时，能否重新预测出该结构。

结合体排序（有基准测试支持）

一项针对 15 个靶标、3,766 个经实验测试结合体的元分析（Overath 等人，bioRxiv 2025，doi:10.1101/2025.08.14.670059）发现，AF3 ipSAE_min 是最佳的单一计算机模拟结合预测指标；由三个特征组成的简单线性模型在不同靶标间的泛化能力最佳。提高复杂度并无帮助：梯度提升模型和使用多个特征的模型都未能胜过线性模型。

该研究推荐的过滤策略：

1. 使用以下任一条件进行阈值筛选：AF3 ipSAE_min > 0.61，或 ipSAE_min × interface_ΔG/ΔSASA < -1.5，或 LIS × shape_complementarity > 0.42。
2. 先按 shape_complementarity > 0.62 和 RMSD_binder < 3.73（输入结构与重新预测结构对比）预筛选，再按 ipSAE_min 选取排名靠前的 K 个。

ipSAE_min 是两个非对称 ipSAE 方向（结合体→靶标和靶标→结合体）中的较小值，不是平均值或最大值。使用 ipsae skill 计算该值。请注意，RMSD_binder 筛选条件对某些靶标可能过于严格，因此最好将其作为软性预筛选条件，而非硬性阈值。

稳定性预测（小型结构域）

对于小型结构域（约 60 到 80 个残基，即迷你结合蛋白的范围），可以直接预测绝对折叠稳定性。SaProtΔG（Cho 等人，bioRxiv 2026，doi:10.64898/2026.05.19.726285）预测绝对折叠 ΔG 的 RMSE 约为 0.8 kcal/mol，并能更好地区分稳定与不稳定的设计蛋白。在商业项目中，请使用 SaProt 变体，而不是 ESM3 变体，因为 ESM3 权重仅限非商业用途。筛选 ΔG 更负（更稳定）的设计。

序列负担扫描

直接将负担检查实现为基序规则，而不是依赖特定于抗体的依赖项。有结构时，根据溶剂暴露程度调整严重程度（通过 SASA 进行筛选）。

import re

LIABILITIES = {
    "deamidation":   (r"N[GSNTH]",   "NG/NS high, NN/NT moderate"),
    "isomerization": (r"D[GSTDH]",   "Asp isomerization"),
    "N-glycosylation": (r"N[^P][ST]", "NxS/T sequon"),
    "polybasic":     (r"[KR]{3,}",   "proteolysis / charge patch"),
    "hydrophobic_run": (r"[AILMFWVY]{6,}", "aggregation"),
}

def scan_liabilities(seq):
    hits = {}
    for name, (pattern, note) in LIABILITIES.items():
        positions = [m.start() for m in re.finditer(pattern, seq)]
        if positions:
            hits[name] = (positions, note)
    # Unpaired cysteine check
    if seq.count("C") % 2 == 1:
        hits["unpaired_cysteine"] = ([seq.index("C")], "odd cysteine count")
    return hits

Met 和 Trp 氧化也是负担，但只有在残基暴露于溶剂时才应标记。

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顺序筛选流水线

import pandas as pd

designs = pd.read_csv('designs.csv')

# Stage 1: Structural confidence
designs = designs[designs['pLDDT'] > 0.85]

# Stage 2: Self-consistency
designs = designs[designs['scRMSD'] < 2.0]

# Stage 3: Binding quality
designs = designs[(designs['ipTM'] > 0.5) & (designs['PAE_interaction'] < 10)]

# Stage 4: Sequence plausibility
designs = designs[designs['esm2_pll_normalized'] > 0.0]

# Stage 5: Expression checks (design-level)
designs = designs[designs['cysteine_count'] % 2 == 0]  # Even cysteines
designs = designs[designs['instability_index'] < 40]

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综合评分（排名必需）

单项指标的表现都不够好。请使用综合评分：

def composite_score(row):
    return (
        0.30 * row['pLDDT'] +
        0.20 * row['ipTM'] +
        0.20 * (1 - row['PAE_interaction'] / 20) +
        0.15 * row['shape_complementarity'] +
        0.15 * row['esm2_pll_normalized']
    )

designs['score'] = designs.apply(composite_score, axis=1)
top_designs = designs.nlargest(100, 'score')

高级综合评分请参阅 references/composite-scoring.md。

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特定工具的筛选

BindCraft 筛选级别

级别	用例	严格程度
Default	标准设计	最严格
Relaxed	需要更多设计	失败率较高
Peptide	< 30 AA 的设计	成功率低约 5-10 倍

BoltzGen 筛选

boltzgen run ... \
  --budget 60 \
  --alpha 0.01 \
  --filter_biased true \
  --refolding_rmsd_threshold 2.0 \
  --additional_filters 'ALA_fraction<0.3'

• alpha=0.0：仅按质量排名
• alpha=0.01：默认值（轻微考虑多样性）
• alpha=1.0：仅按多样性排名

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设计级严重程度评分

对于基于模式的检查，请使用严重程度评分：

严重程度	分数	操作
LOW	0-15	继续
MODERATE	16-35	审查标记的问题
HIGH	36-60	建议重新设计
CRITICAL	61+	必须重新设计

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实验相关性

指标	AUC	用途
ipTM	~0.64	预筛选
PAE	~0.65	预筛选
ESM2 PLL	~0.72	最佳单项指标
Composite	~0.75+	务必使用

关键见解：这些指标适合作为筛选器（排除失败设计），而非预测指标（对成功设计排名）。

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项目健康状况评估

快速评估设计项目：

通过率	状态	说明
> 15%	Excellent	高于平均水平，继续
10-15%	Good	正常，继续
5-10%	Marginal	低于平均水平，检查问题
< 5%	Poor	存在重大问题，进行诊断

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故障恢复树

通过 pLDDT 筛选的设计过少（pLDDT > 0.85 的比例 < 5%）

Low pLDDT across campaign
├── Check scRMSD distribution
│   ├── High scRMSD (>2.5Å): Backbone issue
│   │   └── Fix: Regenerate backbones with lower noise_scale (0.5-0.8)
│   └── Low scRMSD but low pLDDT: Disordered regions
│       └── Fix: Check design length, simplify topology
├── Try more sequences per backbone
│   └── modal run modal_ligandmpnn.py --input-pdb bb.pdb --params-str "--number_of_batches 32 --temperature 0.1"
├── Use SolubleMPNN instead of ProteinMPNN
│   └── Better for expression-optimized sequences
└── Consider different design tool
    └── BindCraft (integrated design) may work better

通过 ipTM 筛选的设计过少（ipTM > 0.5 的比例 < 5%）

Low ipTM across campaign
├── Review hotspot selection
│   ├── Are hotspots surface-exposed? (SASA > 20Ų)
│   ├── Are hotspots conserved? (check MSA)
│   └── Try 3-6 different hotspot combinations
├── Increase binder length (more contact area)
│   └── Try 80-100 AA instead of 60-80 AA
├── Check interface geometry
│   ├── Is target flat? → Try helical binders
│   └── Is target concave? → Try smaller binders
└── Try all-atom design tool
    └── BoltzGen (all-atom, better packing)

scRMSD 偏高（scRMSD > 2.0Å 的比例 > 50%）

Sequences don't specify intended structure
├── ProteinMPNN issue
│   ├── Lower temperature: --sampling_temp "0.1"
│   ├── Increase sequences: --num_seq_per_target 32
│   └── Check fixed_positions aren't over-constraining
├── Backbone geometry issue
│   ├── Backbones may be unusual/strained
│   ├── Regenerate with lower noise_scale (0.5-0.8)
│   └── Reduce diffuser.T to 30-40
└── Try different sequence design
    └── ColabDesign (AF2 gradient-based) may work better

所有设计均通过，但没有实验命中

In silico metrics don't predict affinity
├── Generate MORE designs (10x current)
│   └── Computational metrics have high false positive rate
├── Increase diversity
│   ├── Higher ProteinMPNN temperature (0.2-0.3)
│   ├── Different backbone topologies
│   └── Different hotspot combinations
├── Try different design approach
│   ├── BindCraft (different algorithm)
│   ├── ColabDesign (AF2 hallucination)
│   └── BoltzGen (all-atom diffusion)
└── Check if target is druggable
    └── Some targets are inherently difficult

通过的设计过多（> 50%）

Suspiciously high pass rate
├── Check if thresholds are too lenient
│   └── Use stringent thresholds: pLDDT > 0.90, ipTM > 0.60
├── Verify prediction quality
│   ├── Are predictions actually running? Check output files
│   └── Are complexes being predicted, not just monomers?
├── Check for data issues
│   ├── Same sequence being predicted multiple times?
│   └── Wrong FASTA format (missing chain separator)?
└── Apply diversity filter
    └── Cluster at 70% identity, take top per cluster

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诊断命令

快速项目评估

import pandas as pd

df = pd.read_csv('designs.csv')

# Pass rates at each stage
print(f"Total designs: {len(df)}")
print(f"pLDDT > 0.85: {(df['pLDDT'] > 0.85).mean():.1%}")
print(f"ipTM > 0.50: {(df['ipTM'] > 0.50).mean():.1%}")
print(f"scRMSD < 2.0: {(df['scRMSD'] < 2.0).mean():.1%}")
print(f"All filters: {((df['pLDDT'] > 0.85) & (df['ipTM'] > 0.5) & (df['scRMSD'] < 2.0)).mean():.1%}")

# Identify top issue
if (df['pLDDT'] > 0.85).mean() < 0.1:
    print("ISSUE: Low pLDDT - check backbone or sequence quality")
elif (df['ipTM'] > 0.50).mean() < 0.1:
    print("ISSUE: Low ipTM - check hotspots or interface geometry")
elif (df['scRMSD'] < 2.0).mean() < 0.5:
    print("ISSUE: High scRMSD - sequences don't specify backbone")

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