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sgrna-design-guide

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关于 sgrna-design-guide

这是一本 sgRNA 设计指南，按优先级引导研究者从已验证序列、CRISPick 预计算数据到从头设计逐步选择。内容涵盖 Cas 变体匹配、评分筛选、设计规则和实验验证。

主要功能

  1. 01按三层流程选择 sgRNA
  2. 02查询已验证序列与文献
  3. 03依据 CRISPick 排名筛选
  4. 04匹配 Cas 变体和 PAM
  5. 05提供从头设计规则

适用场景

  1. 01为基因敲除挑选 sgRNA
  2. 02为 CRISPRa 或 CRISPRi 选设计
  3. 03为非模式生物设计引导序列
  4. 04提高候选序列的特异性筛选

安装

复制下面的命令，在终端中运行。

$npx skills add https://github.com/jaechang-hits/sciagent-skills --skill sgrna-design-guide

安装后在 Claude Code 中输入/sgrna-design-guide确认已加载。

附带文件resource/addgene_grna_sequences.csvresource/CRISPick_download_links.txt

详细介绍

sgRNA 设计指南：三级方案

元数据

简短描述：使用经过验证的序列、CRISPick 数据集或从头设计工具查找或设计 sgRNA 的综合指南。

作者：Ohagent Team

版本：1.0

最后更新：2025 年 11 月

许可证：CC BY 4.0

商业用途：允许

引用与致谢

如果使用我们数据库中经过验证的 sgRNA（选项 1）：
如果使用 CRISPick 设计（选项 2）：
  • 致谢声明："引导序列设计由 Broad Institute 的 GPP 提供的 CRISPick 网络工具生成"
  • Cas9 设计引用（SpCas9、SaCas9）：Sanson KR, et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nat Commun. 2018;9(1):5416. PMID: 30575746
  • Cas12a 设计引用（AsCas12a、enAsCas12a）：DeWeirdt PC, et al. Optimization of AsCas12a for combinatorial genetic screens in human cells. Nat Biotechnol. 2021;39(1):94-104. PMID: 32661438
    • 注：本文介绍了 enAsCas12a 的优化；请在方法部分注明所用变体

概述

本指南提供 sgRNA 设计的三级方案，优先使用经过验证的序列，再考虑计算预测。始终从选项 1 开始，仅在有需要时再继续采用后续选项。

核心概念

经过验证的 sgRNA 数据库（第 1 级）

经过验证的 sgRNA 是指在已发表研究中经过实验测试的引导序列，并记录了细胞系、切割效率以及（通常还包括）脱靶特征。Addgene 会连同携带这些序列的已存档质粒一起整理此类序列；可下载的 CSV（addgene_grna_sequences.csv）提供可搜索的索引，字段包括基因符号、目标物种和应用（切割／激活／RNA 靶向）。优先使用经过验证的 sgRNA，因为 CRISPR 实验失败的最大原因是靶向活性不佳，而这一问题在最初的验证中本可被发现。

计算 sgRNA 评分（第 2 级）

如果没有经过验证的 sgRNA，次优选择是使用 Broad Institute 的 CRISPick 服务提供的预先计算的全基因组设计。CRISPick 提供 238 个数据集，涵盖多种基因组、Cas 变体和应用；其中每条候选引导序列均按靶向效率（切割的可靠程度）、脱靶特异性（在其他位置发生切割的可能性）和兼顾两者的综合排名进行排序。CRISPick 背后的靶向模型为 Sanson 2018（Cas9）和 DeWeirdt 2021（Cas12a）。综合排名是建议的默认选项；只有当实验特别优先考虑其中一项时，才使用靶向排名或脱靶排名。

脱靶严格度与 PAM 兼容性

不同 Cas 变体对 PAM（原间隔序列邻近基序）的要求不同：SpCas9 需要 NGG（3'），SaCas9 需要 NNGRRT（3'），AsCas12a 和 enAsCas12a 需要 TTTV（5'）。重要的是，AsCas12a 和 enAsCas12a 是不同的酶：enAsCas12a 是活性范围更广的工程化变体，针对其中一种优化的引导序列在另一种上的表现不会完全相同。请始终确保 CRISPick 数据集与实验室使用的 Cas 变体完全匹配。脱靶严格度阈值（通常为 Off-Target Rank 或 CFD 风格评分）需要在特异性与候选序列数量之间权衡——阈值越严格，得到的引导序列越少，但质量越高。

从头设计规则（Tier 3）

当目标不在经过验证的序列或预计算数据集覆盖范围内（非模式生物、定制位点等）时，应用基于规则的设计：SpCas9/SaCas9 使用 20 bp 原间隔序列（Cas12a 使用 23–25 bp），GC 含量为 40–60%，避免出现 TTTT（Pol III 终止子）和长度 >4 的同聚物串。靶向位置也很重要：敲除应靶向早期外显子（编码序列的前 50%）；CRISPRa 应靶向距 TSS −200 至 +1 的区域；CRISPRi 应靶向距 TSS −50 至 +300 的区域。

决策框架

sgRNA design decision tree
└── Does Addgene database (Tier 1) contain a validated sgRNA for your gene + species + application?
    ├── Yes -> Use the validated sgRNA(s); cite the original PubMed reference
    └── No  -> Run advanced literature search (mandatory before Tier 2)
        ├── Found in literature -> Use the literature sgRNA; cite the paper
        └── Still no match -> Is the target organism + Cas variant covered by a CRISPick dataset (Tier 2)?
            ├── Yes -> Download dataset, filter by gene, sort by Combined Rank
            │         └── Pick top 3-4 sgRNAs (ideally from different exons for redundancy)
            └── No  -> De novo design (Tier 3) using 20 bp / PAM / GC / avoid-TTTT rules
                      └── Validate experimentally (Sanger / T7E1 / amplicon-seq)
情况推荐层级理由
有既往 CRISPR 研究的常见人类/小鼠基因Tier 1（Addgene + 文献）经过验证的序列附有实测切割效率；实验风险最低
模式生物的全基因组规模筛选Tier 2（CRISPick）预计算数据集覆盖整个基因组，评分一致
单个人类基因敲除，没有 Addgene 命中结果Tier 2（CRISPick GRCh38 SpCas9 CRISPRko），按 Combined Rank 筛选对于一次性敲除，效率与特异性之间的平衡最佳
CRISPRa / CRISPRi 实验Tier 2，使用匹配的 CRISPRa / CRISPRi 数据集激活/抑制模型靶向近端启动子窗口，而非编码外显子
Cas12a（AsCas12a 与 enAsCas12a）Tier 2，使用准确匹配的 Cas12a 变体数据集一种变体的向导 RNA 不能与另一种互换使用
CRISPick 未覆盖的非模式生物Tier 3（从头设计规则）不存在高通量训练数据；采用基于规则的设计并进行实验验证
小型定制位点（例如，工程化盒）Tier 3该位点不在任何参考基因组中；直接针对目标序列设计
需要最高特异性（例如，治疗应用）Tier 2，按脱靶排名排序优先选择预测脱靶位点最少的向导 RNA
需要最高切割效率（例如，难处理的细胞系）Tier 2，按靶向排名排序接受略高的脱靶风险，以换取活性

最佳实践

  1. 转向 Tier 2 前，务必先穷尽 Tier 1 的所有方法。 即使 addgene_grna_sequences.csv 没有返回任何行，也要执行文献检索步骤（方法 2）。许多经过验证的 sgRNA 已发表在补充材料中，但从未提交到 Addgene。
  2. 让 CRISPick 数据集与 Cas 变体准确匹配。 AsCas12a 和 enAsCas12a 是不同的酶；SpCas9 和 SaCas9 需要不同的 PAM。使用错误的数据集会浪费实验资源。
  3. 默认使用 Combined Rank 进行筛选。 它兼顾靶向效率和脱靶特异性；只有在实验有特定理由需要优先考虑其中一项时，才使用 On-Target Rank 或 Off-Target Rank。
  4. 每个目标基因订购 3–4 条 sgRNA，最好来自不同外显子。 单条向导 RNA 可能因与预测评分无关的原因而失效（染色质环境、二级结构、PCR 脱落）。增加冗余是低成本的保障。
  5. 敲除时，靶向编码序列的前 50%。 N 端切割最有可能通过 NMD 产生真正的功能缺失；C 端切割可能留下部分有功能的蛋白质。
  6. CRISPRa 的设计位置应在距 TSS −200 至 +1 bp 范围内；CRISPRi 则应在 −50 至 +300 bp 范围内。 超出这些窗口后，效应器活性会急剧下降。
  7. 进行实验验证。 即使排名很高的向导 RNA，仍有约 20–30% 的概率失效。在开展表型实验前，使用 Sanger 测序、T7E1、ICE 或扩增子测序确认编辑结果。
  8. Tier 1 应引用原始验证论文；Tier 2 应引用 CRISPick + Sanson 2018 / DeWeirdt 2021。 要确保可重复性，每条向导 RNA 序列都必须有可追溯的来源。

常见陷阱

  • 陷阱：Addgene CSV 没有匹配结果时，跳过文献检索步骤（方法 2）。

    • 避免方法：将方法 2 视为必做步骤；许多经过验证的向导序列只出现在已发表论文的补充材料中。

  • 陷阱：因为 AsCas12a 和 enAsCas12a 都使用 TTTV PAM，就将 AsCas12a 向导序列用于 enAsCas12a（或反之）。

    • 避免方法：确保 CRISPick 数据集文件名中的 Cas 标记（AsCas12a 与 enAsCas12a）与实验中使用的具体酶变体一致。

  • 陷阱：仅按 On-Target Rank 排序，结果选出活性高但特异性低、会导致脱靶编辑的向导序列。

    • 避免方法：默认使用 Combined Rank；只有实验明确要求极高效率或特异性时才偏离这一做法。

  • 陷阱：每个基因只设计一条 sgRNA，一旦失败就得出“向导序列不起作用”的结论。

    • 避免方法：务必针对每个基因，从不同位点／外显子选择 3–4 条向导序列订购并测试。

  • 陷阱：敲除时靶向靠后的外显子或 3' UTR。 靠后外显子的编辑通常会产生仍保留部分功能的截短蛋白，干扰表型解读。

    • 避免方法：敲除时，只选择编码序列前 50% 范围内（或前 3 个外显子）的候选序列。

  • 陷阱：在 CRISPRa 或 CRISPRi 实验中使用 CRISPRko 数据集。 原间隔序列窗口不同：敲除针对编码外显子，激活／抑制则针对近端启动子。

    • 避免方法：下载应用标签（CRISPRko／CRISPRa／CRISPRi）与实验相符的数据集。

  • 陷阱：设计包含 TTTT 的向导序列。 该序列会终止 RNA Pol III 转录，因此 sgRNA 无法从 U6 启动子表达。

    • 避免方法：始终筛除全新设计的序列（并仔细检查 Tier 1／2 候选序列）中的 TTTT 和长度 >4 的同聚物。

  • 陷阱：引用经过验证的 sgRNA 时未注明原始论文。

    • 避免方法：将 Addgene CSV 中的 PubMed_ID（或文献检索得到的 DOI）记入设计记录，并在方法部分注明。

选项 1：搜索已验证的 sgRNA 序列（优先推荐）

1.1 搜索已验证的 sgRNA

重要：在继续选项 2 之前，必须完成方法 1 和方法 2。即使方法 1 没有找到结果，也不得跳过方法 2。

方法 1：搜索我们的数据库（最快）

我们维护着一个经过整理的数据库，其中包含 300 多条有实验依据的已验证 sgRNA 序列，来自 Addgene。

位置：resource/addgene_grna_sequences.csv（相对于此技能目录）

搜索数据库：

import pandas as pd

# Load the database
df = pd.read_csv('addgene_grna_sequences.csv')

# Search for your gene
gene_name = "TP53"
results = df[df['Target_Gene'].str.upper() == gene_name.upper()]

# Filter by species and application
results_filtered = results[
    (results['Target_Species'] == 'H. sapiens') &
    (results['Application'] == 'cut')  # or 'activate', 'RNA targeting'
]

# Display results with references
print(results_filtered[['Target_Gene', 'Target_Sequence',
                        'Plasmid_ID', 'PubMed_ID', 'Depositor']])

数据库列：

  • Target_Gene：基因符号
  • Target_Species：物种（H. sapiens、M. musculus 等）
  • Target_Sequence：20 bp sgRNA 序列（5' 至 3'）
  • Application：切割（敲除）、激活（CRISPRa）、RNA 靶向（CRISPRi）
  • Cas9_Species：S. pyogenes、S. aureus 等
  • Plasmid_ID：Addgene 质粒编号
  • Plasmid_URL：质粒页面的直接链接
  • PubMed_ID：出版物引用（请在工作中引用）
  • PubMed_URL：论文的直接链接
  • Depositor：提供该序列的研究实验室
方法 2：高级网络搜索（必需——不可跳过）

重要：即使方法 1 没有找到任何结果，也必须先进行文献搜索，然后再转到选项 2。许多经过验证的 sgRNA 已发表在文献中，但未收录在 Addgene 数据库中。

使用 ohagent.tool.literature 中的 advanced_web_search_claude 搜索文献和数据库，查找经过验证的 sgRNA：

from ohagent.tool.literature import advanced_web_search_claude

# Example usage
results = advanced_web_search_claude("sgRNA TP53 validated H. sapiens experimental")

可尝试的搜索查询（使用多个）：

"sgRNA" OR "guide RNA" "[GENE_NAME]" validated experimental
"CRISPR knockout" "[GENE_NAME]" sgRNA sequence validated
"[GENE_NAME]" sgRNA "cutting efficiency" OR "on-target"
"[GENE_NAME]" "guide sequence" CRISPR validated

TP53 示例：

"sgRNA" "TP53" validated "H. sapiens" experimental
"CRISPR knockout" "TP53" guide sequence validated

在结果中查找：

  • 含有经过验证的 sgRNA 序列的已发表论文
  • 含有 sgRNA 序列的补充材料
  • 其他 CRISPR 数据库（例如 GenScript、Horizon Discovery）
  • 提供特定 sgRNA 序列的实验室方案

重要：请投入充足时间搜索文献。至少查看前 10–15 条搜索结果，并检查相关论文的补充材料。

如何处理搜索结果：

如果找到匹配的 sgRNA（来自任一方法）：

  1. 记录 sgRNA 序列（20 bp 靶序列）
  2. 注明参考文献：
    • 来自数据库：使用 PubMed_ID 引用原始论文
    • 来自网络搜索：记录论文的 DOI/PubMed ID
  3. 记录验证详情：细胞系、切割效率以及报告的脱靶情况

结果格式示例：

Gene: TP53
sgRNA sequence: GAGGTTGTGAGGCGCTGCCC
Species: H. sapiens (human)
Application: Knockout (cut)
Reference: PubMed ID 24336569 (Ran et al., 2013)
Validation: Tested in HEK293T cells, 85% cutting efficiency

如果方法 1 和方法 2 均未找到匹配项： 此时才继续执行选项 2：下载 CRISPick 数据集

选项 2：从 CRISPick 下载预计算的 sgRNA

何时使用此选项？
  • 在 Addgene 中找不到经过验证的 sgRNA
  • 需要全面覆盖某个基因
  • 希望获得多个带预测评分的 sgRNA 选项
  • 正在进行全基因组筛选
2.1 CRISPick 概述

CRISPick（来自 Broad Institute GPP）提供针对整个基因组的预计算 sgRNA 设计，共有 238 个可用数据集，涵盖：

  • 人类（GRCh38、GRCh37）
  • 小鼠（GRCm38、GRCm39）
  • 狗、牛、猴和其他模式生物
  • 多种 Cas 酶（SpCas9、SaCas9、AsCas12a、enAsCas12a）
    • 重要：AsCas12a 和 enAsCas12a 是不同的酶
    • AsCas12a：野生型 Acidaminococcus sp. Cas12a
    • enAsCas12a：活性有所提升的增强型变体
    • 关键提示：针对 enAsCas12a 设计的 sgRNA 可能无法用于野生型 AsCas12a
    • 请务必选择与具体 Cas12a 变体匹配的数据集
  • 不同应用（敲除、激活、抑制）
2.2 查找下载链接

全部 238 个下载链接可在：resource/CRISPick_download_links.txt 中找到（相对于此技能目录）

第 1 步：了解文件命名规则

文件命名格式：sgRNA_design_{TAXID}_{GENOME}_{CAS}_{APPLICATION}_{ALGORITHM}_{SOURCE}_{DATE}.txt.gz

常见数据集：

| 生物 | 基因组 | Cas9 | 应用 | 搜索模式 | |-|--||-|-| | 人类 | GRCh38 | SpCas9 | 敲除 | 9606_GRCh38_SpyoCas9_CRISPRko | | 人类 | GRCh38 | SpCas9 | 激活 | 9606_GRCh38_SpyoCas9_CRISPRa | | 人类 | GRCh38 | SaCas9 | 敲除 | 9606_GRCh38_SaurCas9_CRISPRko | | 小鼠 | GRCm38 | SpCas9 | 敲除 | 10090_GRCm38_SpyoCas9_CRISPRko | | 小鼠 | GRCm38 | SpCas9 | 激活 | 10090_GRCm38_SpyoCas9_CRISPRa |

关键组成部分：

  • TAXID：9606（人类）、10090（小鼠）、9615（狗）、9913（牛）
  • CAS：
    • SpyoCas9（SpCas9，NGG PAM）
    • SaurCas9（SaCas9，NNGRRT PAM）
    • AsCas12a（野生型 Cas12a，TTTV PAM）
    • enAsCas12a（增强型 Cas12a，TTTV PAM）
    • 警告：如果你使用的是 enAsCas12a，请勿使用 AsCas12a 数据集；反之亦然
  • APPLICATION：CRISPRko（敲除）、CRISPRa（激活）、CRISPRi（抑制）
第 2 步：查找下载 URL
# Search the download links file
grep "9606_GRCh38_SpyoCas9_CRISPRko" resource/CRISPick_download_links.txt

# Or for mouse
grep "10090_GRCm38_SpyoCas9_CRISPRko" resource/CRISPick_download_links.txt
第 3 步：下载并解压
# Copy the URL from download_links.txt, then:
wget [PASTE_URL_HERE]

# Extract the file
gunzip sgRNA_design_*.txt.gz

文件大小：敲除（300–700 MB）、激活（50–100 MB）、汇总文件（1–3 MB）

2.4 了解文件格式

.txt 文件使用制表符分隔。敲除数据集与激活/抑制数据集的列名不同。

必需列（所有文件）：

  • sgRNA Sequence：20 bp 的向导 RNA 序列（5' 到 3'）
  • Target Gene Symbol：基因名称（例如，“TP53”“BRCA1”）
  • Combined Rank：综合排名（数值越低越好）——默认使用此列
  • On-Target Rank：仅按效率排名（数值越低越好）
  • Off-Target Rank：仅按特异性排名（数值越低越好）
  • PAM Sequence：PAM 序列（例如，“AGG”“TGG”）

敲除专用列：

  • sgRNA Cut Position (1-based)：切割位点的基因组坐标
  • Exon Number：靶向的外显子编号
  • Target Cut %：受影响的蛋白质百分比

激活/抑制专用列：

  • sgRNA 'Cut' Position：相对于基因的位置
  • sgRNA 'Cut' Site TSS Offset：与转录起始位点的距离（bp）
  • DHS Score：DNase 超敏性评分（用于 CRISPRa）
2.5 提取并选择 sgRNA
步骤 1：加载数据并筛选目标基因
import pandas as pd

# Load the dataset
df = pd.read_csv('sgRNA_design_9606_GRCh38_SpyoCas9_CRISPRko_*.txt',
                 sep='\t', low_memory=False)

# Filter for your gene
gene_name = "TP53"
gene_sgrnas = df[df['Target Gene Symbol'] == gene_name].copy()

print(f"Found {len(gene_sgrnas)} sgRNAs for {gene_name}")
步骤 2：选择排名靠前的 sgRNA

默认：使用 Combined Rank（平衡效率和特异性）

# Sort by Combined Rank (lower is better)
top_sgrnas = gene_sgrnas.nsmallest(10, 'Combined Rank')

print(top_sgrnas[['sgRNA Sequence', 'Combined Rank',
                   'Exon Number', 'sgRNA Cut Position (1-based)']])

选项 A：优先考虑靶向效率

# Sort by On-Target Rank (for maximum cutting efficiency)
efficient_sgrnas = gene_sgrnas.nsmallest(10, 'On-Target Rank')

选项 B：优先考虑脱靶特异性

# Sort by Off-Target Rank (for maximum specificity)
specific_sgrnas = gene_sgrnas.nsmallest(10, 'Off-Target Rank')
步骤 3：按自定义条件筛选（可选）

按外显子编号筛选：

# Target specific exon (e.g., exon 5)
exon5_sgrnas = gene_sgrnas[gene_sgrnas['Exon Number'] == 5]
top_exon5 = exon5_sgrnas.nsmallest(5, 'Combined Rank')

按基因组位置筛选：

# Target specific genomic range
position_filtered = gene_sgrnas[
    (gene_sgrnas['sgRNA Cut Position (1-based)'] >= 7572000) &
    (gene_sgrnas['sgRNA Cut Position (1-based)'] <= 7575000)
]

敲除时靶向较早的外显子：

# Get sgRNAs from first 3 exons
early_exons = gene_sgrnas[gene_sgrnas['Exon Number'] <= 3]
top_early = early_exons.nsmallest(10, 'Combined Rank')

按靶向切割百分比筛选：

# Target sgRNAs that affect significant portion of protein
high_impact = gene_sgrnas[gene_sgrnas['Target Cut %'] <= 50]  # Cut in first 50%
top_high_impact = high_impact.nsmallest(10, 'Combined Rank')
步骤 4：选择多个 sgRNA 进行验证
# Get top 4 sgRNAs from different exons for redundancy
final_selection = gene_sgrnas.sort_values('Combined Rank').groupby('Exon Number').head(1).head(4)

# Save results
final_selection.to_csv(f'{gene_name}_selected_sgRNAs.csv', index=False)

print("\nSelected sgRNAs:")
print(final_selection[['sgRNA Sequence', 'Exon Number', 'Combined Rank']])
2.6 如何处理结果

选择好 sgRNA 后：

  1. 选择 3-4 条 sgRNA（默认使用 Combined_Rank）

如果数据集未涵盖你的基因或生物体： 继续执行 选项 3：从头设计 sgRNA

选项 3：sgRNA 通用设计指南（最后手段）

何时使用此选项？
  • CRISPick 数据集中未涵盖该基因
  • 非模式生物
  • 有自定义设计要求
通用设计规则
必要要求：
  1. 长度：
    • SpCas9 和 SaCas9 为 20 bp
    • Cas12a 变体（AsCas12a、enAsCas12a）为 23-25 bp
  2. PAM 序列：
    • SpCas9：要求靶序列后方（3' 端）紧接 NGG
    • SaCas9：要求靶序列后方（3' 端）紧接 NNGRRT
    • AsCas12a（野生型）：要求靶序列前方（5' 端）为 TTTV
    • enAsCas12a（增强型）：要求靶序列前方（5' 端）为 TTTV
    • 重要提示：由于活性特征不同，为 enAsCas12a 设计的向导序列可能无法用于野生型 AsCas12a
  3. GC 含量：40-60% 为最佳
  4. 避免：
    • TTTT 序列（会终止转录）
    • 连续出现过多相同核苷酸（重复次数 >4）
靶向位置：
  • 用于敲除：靶向较早的外显子（基因前 50%）
  • 用于激活：靶向距离转录起始位点（TSS）-200 至 +1 bp 的区域
  • 用于抑制：靶向距离 TSS -50 至 +300 bp 的区域
最佳实践：
  • 每个目标基因测试 3-4 条不同的 sgRNA
  • 选择效率评分高（>0.5）且脱靶少的 sgRNA
  • 使用 Sanger 测序进行实验验证

快速入门示例

示例 1：在人体细胞中敲除 TP53

步骤 1：检查 Addgene

df = pd.read_csv('addgene_grna_sequences.csv')
tp53_results = df[(df['Target_Gene'] == 'TP53') &
                  (df['Target_Species'] == 'H. sapiens') &
                  (df['Application'] == 'cut')]
# Result: Found 0 entries -> Proceed to Option 2

步骤 2：下载 CRISPick 数据集

# Download human GRCh38 SpCas9 knockout dataset
wget https://portals.broadinstitute.org/gppx/public/sgrna_design/api/downloads/\
sgRNA_design_9606_GRCh38_SpyoCas9_CRISPRko_RS3seq-Chen2013+RS3target_NCBI_20241104.txt.gz

gunzip sgRNA_design_9606_GRCh38_SpyoCas9_CRISPRko_*.txt.gz

步骤 3：提取 TP53 sgRNA

df = pd.read_csv('sgRNA_design_9606_GRCh38_SpyoCas9_CRISPRko_*.txt', sep='\t')
tp53 = df[df['Gene_Symbol'] == 'TP53']
top_sgrnas = tp53[
    (tp53['sgRNA_score'] > 0.6) &
    (tp53['Off_target_stringency'] > 0.5)
].sort_values('sgRNA_score', ascending=False).head(4)

print(top_sgrnas[['sgRNA_sequence', 'sgRNA_score', 'Exon_ID']])
示例 2：在人体 iPSC 中激活 OCT4

步骤 1：检查 Addgene

oct4_results = df[(df['Target_Gene'] == 'OCT4') &
                  (df['Application'] == 'activate')]
# Found 1 validated sgRNA!
print(oct4_results['Target_Sequence'].values[0])
# Use this sequence

请记住：始终从已验证的序列（选项 1）开始，然后使用预先计算的设计（选项 2），仅在必要时才使用从头设计（选项 3）。无论预测评分如何，每个基因测试 3-4 条 sgRNA 都是标准做法。

参考资料

评论

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