tooluniverse-molecular-cloning

分子克隆组装设计（Gibson 与 Golden Gate）

规划如何将 DNA 片段连接成一个构建体：设计同源重叠区（Gibson）或 Type IIS 黏性末端（Golden Gate），并避免因内部酶切位点和非唯一连接位点导致的失败。

步骤 0 — 选择方法

适用 Gibson Assembly 的情况	适用 Golden Gate 的情况
片段较少，且可在任意位置实现无疤痕/无缝连接	部件较多，需要标准化、可重复使用的部件（MoClo/模块化），并进行一锅组装
可通过 PCR 添加约 20–40 bp 的同源序列	可去除内部 BsaI/BbsI 位点（去除酶切位点）
一次性构建体	组合文库/重复组装

两种方法都与序列无关（Gibson 在连接处没有疤痕；Golden Gate 会留下 4 bp 的融合疤痕）。对于 2–4 个唯一片段，Gibson 通常最简单；对于文库或部件工具包，则使用 Golden Gate。

步骤 1 — Gibson Assembly

tu run DNA_gibson_design '{"operation":"gibson_design",
  "fragments":["ATGGCG...GAGGAC","GAGGAC...GGCAAG","GGGCAAG...ATCCT"],
  "overlap_length":20}'

对于每个片段，工具会返回 left_overlap、right_overlap 和 with_overlaps（即添加了同源臂的片段序列，这些同源臂需要加到 PCR 引物上——请将其交给 tooluniverse-primer-design）。

Gibson 设计规则

• 同源重叠区长度为 15–40 bp（通常为 20–25 bp）；对于 GC 含量较低的连接位点，使用更长的重叠区。
• 重叠区 Tm ≈ 48–65 °C，且各连接位点之间应保持平衡。
• 片段顺序很重要 — 按组装顺序列出片段；只有在构建环状分子（载体）时，最后一个片段的 3′ 端才会与第一个片段重叠。
• 避免连接位点处出现重复序列/二级结构（发夹、直接重复）→ 可能导致错误组装。
• 确保连接位点唯一 — 如果两个连接位点具有相同的同源序列，片段可能会互换；重新设计，确保每个重叠区都唯一。

步骤 2 — Golden Gate Assembly

tu run DNA_golden_gate_design '{"operation":"golden_gate_design",
  "parts":["ATGGCG...AAGAAC","CTGAGC...CTGATC","GAGGAG...GTGGTG"],
  "enzyme":"BsaI"}'

返回 parts_with_overhangs：每个部件唯一的 4 bp left_overhang/right_overhang，以及两侧带有 Type IIS 识别位点的 full_sequence（例如 BsaI GGTCTC(N1)……在其位点外切割，从而留下 4 bp 的融合黏性末端）。

Golden Gate 设计规则

• 必须去除内部酶切位点。 所选酶的位点（BsaI GGTCTC、BbsI GAAGAC）不得出现在任何部件内部，否则会被内部切割。组装前通过同义突变去除内部位点——检查每个部件。对于不常用的酶，或部件中的内部位点无法通过同义突变去除且需要改用同裂酶时，不要依赖记忆中的识别位点：REBASE_get_enzyme（位点 + 甲基化敏感性）和 REBASE_list_isoschizomers（切割相同位点的替代酶）是权威查询工具。
• 黏性末端必须唯一且非回文。 每个 4 bp 融合位点都必须与其他位点不同，且不能与其自身的反向互补序列相同，否则连接位点可能错误连接。该工具会分配唯一的非回文黏性末端；请保留这些末端。
• 避免 GC 含量过高或全为 AT 的黏性末端；已发表的高保真黏性末端集合（例如 Potapov 2018）连接效果最干净。
• 组装顺序由黏性末端编码，而非由列表顺序决定 — 4 bp 连接位点定义了组装方式。

步骤 3 — 下单前进行 QC

scripts/cloning_qc.py 会检查部件是否存在上述问题：内部 BsaI/BbsI 位点（Golden Gate）、黏性末端唯一性/回文，以及 Gibson 重叠区的 GC 含量/长度，并标记 PASS/WARN。

步骤 4 — 注意事项（请说明这些内容）

• 内部 Type IIS 位点（Golden Gate）— 这是最常见的失败原因；务必去除每个部件中的内部位点。
• 非唯一的 Gibson 重叠区或共享的同源序列 → 片段互换/错误组装。
• 重复序列和较强的二级结构会降低两种方法在连接位点处的效率。
• 重叠区 Tm 不平衡（Gibson）→ 部分连接位点可以形成，其他则不能。
• 生成片段仍需使用带有附加重叠区/黏性末端的引物——请在 tooluniverse-primer-design 中设计并进行 QC（并通过 BLAST 检查特异性）。

逆向推理——现有的组装产物是什么？

逆向问题（“我用 Esp3I 在 Golden Gate 反应中组合了这些质粒——产物会表达什么／gRNA 靶向什么？”）只需调用一次即可回答。不要手动编写酶切／连接模拟器。

tu run DNA_golden_gate_assemble '{"fragments":["<plasmid1>","<plasmid2>","<plasmid3>"],
    "enzyme":"Esp3I","labels":["pLAB-CTU","pLAB-gTU2E","pLAB-CH3"]}'

它会酶切每个输入，丢弃保留识别位点的片段（这些片段会在反应中再次被切开，无法保留下来），通过匹配 4 bp 黏性末端连接其余片段，并返回 product_sequence、product_length 和 assembly_order，其中包含每个连接处的黏性末端。除非传入 circular: false，否则输入均按环状质粒处理。

然后注释产物。在 product_sequence 中定位各项特征（启动子、ORF、gRNA 间隔序列）。对于 gRNA 表达盒，间隔序列是紧邻支架序列（GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG）5′ 端的约 20 nt；通过将该间隔序列与基因组进行比对，确定其靶标（使用 BLAST_*，或查询 Ensembl/NCBI/SGD 序列），并检查其旁边是否有 PAM。匹配构建体所暗示的物种——酵母 tRNA/Pol III 元件意味着要搜索酵母基因组，而不是人类基因组。

如果组装结果显示片段无法连接，请使用 DNA_virtual_digest（circular: true）分别酶切各输入，查看每个质粒释放了哪些片段：Golden Gate 供体质粒的两个 Type IIS 位点以相反方向围绕插入片段，因此正确酶切后每个质粒应得到 2 个片段。如果只得到 1 个，说明酶名称或 circular 设置有误——并非质粒缺少位点。

酶名称：Esp3I 和 BsmBI 是同一种酶（CGTCTC）；BsaI（GGTCTC）、BbsI（GAAGAC）和 SapI（GCTCTTC）也都可以识别。

明确的限制

• 对酶切和由黏性末端驱动的连接进行了忠实模拟（DNA_virtual_digest 和 DNA_golden_gate_assemble 会按每种酶的实际切割偏移切开两条链，包括在识别位点外切割的 Type IIS 酶）。但未对反应效率建模——例如黏性末端连接偏好、不完全酶切和可能但不正确的连接——因此返回的产物是预期的组装结果，而非产率预测。请对组装后的构建体进行测序验证。
• 不检查载体骨架或 ORF 阅读框——请自行确认阅读框和骨架兼容性。

相关技能

• tooluniverse-primer-design — 设计 PCR 引物（带同源臂／Type IIS 尾），以制备这些片段。
• tooluniverse-sequence-analysis — 处理输入序列。