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治疗性蛋白设计

借助 AI 指导的从头蛋白质设计，使用 RFdiffusion 生成骨架、使用 ProteinMPNN 优化序列，并通过结构验证推进治疗性蛋白开发。

关键原则：

1. 结构优先 - 先生成骨架几何结构，再设计序列
2. 靶标导向 - 结合靶标结构设计结合蛋白
3. 迭代验证 - 预测结构以验证设计
4. 考虑可开发性 - 考虑聚集、免疫原性和表达
5. 证据分开报告 - 分别报告折叠、结合姿势、几何结构、质子化和实验方面的证据
6. 提供可操作的输出 - 提供可用于实验测试的序列
7. 查询优先使用英语 - 调用工具时始终使用英语术语

治疗性蛋白设计从靶标相互作用入手。你需要覆盖哪个结合表面？小口袋 = 纳米抗体或肽。大而平坦的表面 = 设计蛋白。稳定性、免疫原性和可制造性都会限制设计空间。

查证，不要猜测

对任何不确定的科学事实，请先搜索数据库，而不是依赖记忆推理。数据库验证过的答案总是比猜测更可靠。

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计算，不要只描述

如果分析需要计算（统计、数据处理、评分、富集），请通过 Bash 编写并运行 Python 代码。不要只描述你打算怎么做——请实际执行并报告真实结果。使用 ToolUniverse 工具检索数据，再使用 Python（pandas、scipy、statsmodels、matplotlib）进行分析。

适用场景

用户提出以下需求时使用：

• 设计蛋白质结合蛋白、治疗性蛋白或支架
• 优化蛋白质序列的功能
• 设计从头酶
• 生成用于结合靶标的蛋白质变体

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工作流概览

Phase 1: Target Characterization
  Get structure (PDB, EMDB cryo-EM, AlphaFold), identify binding epitope

Phase 2: Backbone Generation (RFdiffusion)
  Define constraints, generate >= 5 backbones, filter by geometry

Phase 3: Sequence Design (ProteinMPNN)
  Design >= 8 sequences per backbone, sample with temperature control

Phase 4: Structure Validation (ESMFold/AlphaFold2)
  Predict structure, compare to backbone, assess pLDDT/pTM

Phase 5: Developability Assessment
  Aggregation, pI, expression prediction

Phase 6: Report Synthesis
  Ranked candidates, FASTA, experimental recommendations

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关键要求

对于迭代式设计、预测结果冲突、糖基化受体检查、条件性 pH 结合或竞争实验准备，请将蛋白质设计工作流与本工作流配合使用。执行示例前，请核实已安装工具的模式；模型置信度和成功执行并不能证明存在结合。

报告优先方法（必须执行）

1. 首先创建 [TARGET]_protein_design_report.md，并添加各节标题
2. 随着设计生成，逐步更新报告
3. 输出 [TARGET]_designed_sequences.fasta 和 [TARGET]_top_candidates.csv

设计文档（必须提供）

每项设计都必须包含：序列、长度、靶标、方法，以及可用的质量指标（pLDDT、pTM、MPNN 分数、结合预测）。将不可用的指标标记为未测量或未计算；不得编造结合预测或实验数值。

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NVIDIA NIM 工具

工具	用途	关键参数
NvidiaNIM_rfdiffusion (需要 NVIDIA_API_KEY 环境变量；可在 build.nvidia.com 免费获取密钥)	骨架生成	contigs + input_pdb（两者均必需），diffusion_steps（不是 num_steps；默认值为 15）
NvidiaNIM_proteinmpnn (需要 NVIDIA_API_KEY 环境变量；可在 build.nvidia.com 免费获取密钥)	序列设计	input_pdb（必需；不是 pdb 或 pdb_string）、num_seq_per_target、sampling_temp（列表）
ESMFold_predict_structure	快速验证	sequence（不是 seq）
NvidiaNIM_alphafold2 (需要 NVIDIA_API_KEY 环境变量；可在 build.nvidia.com 免费获取密钥)	根据序列进行高精度结构推断	sequence、algorithm
NvidiaNIM_esm2_650m (需要 NVIDIA_API_KEY 环境变量；可在 build.nvidia.com 免费获取密钥)	序列嵌入	sequences、format

常见参数错误

工具	错误写法	正确写法
NvidiaNIM_rfdiffusion (需要 NVIDIA_API_KEY)	num_steps=50	diffusion_steps=50（另需提供必填的 contigs 和 input_pdb）
NvidiaNIM_proteinmpnn (需要 NVIDIA_API_KEY)	pdb=content 或 pdb_string=content	input_pdb=content
ESMFold_predict_structure	seq="MVLS..."	sequence="MVLS..."
NvidiaNIM_alphafold2 (需要 NVIDIA_API_KEY)	seq="MVLS..."	sequence="MVLS..."

NVIDIA NIM 要求

• API 密钥：需要设置 NVIDIA_API_KEY 环境变量
• 速率限制：每分钟 40 次请求（两次调用之间至少间隔 1.5 秒）
• AlphaFold2 可能返回 202（需要轮询）；RFdiffusion 和 ESMFold 为同步操作

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辅助工具

工具	用途	关键参数
PDBe_get_uniprot_mappings	查找 PDB 结构	uniprot_id
RCSBData_get_entry	下载 PDB 文件	pdb_id
alphafold_get_prediction	获取 AlphaFold DB 结构	accession
EMDB_search_structures	搜索冷冻电镜图谱	query
EMDB_get_structure	获取条目详情	entry_id
UniProt_get_entry_by_accession	获取目标序列	accession
InterPro_get_protein_domains	获取结构域	accession

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折叠与可开发性筛选

以下是用于说明的计算筛选等级，并非结合证据等级或经过校准的成功概率。 请使用适当的对照进行基准筛选。 单体 pLDDT/pTM 无法确定复合物构象、亲和力、跨物种结合 或 pH 选择性。请分别报告这些维度，并注明缺失的证据。

等级	标准
T1（本筛选中最强）	pLDDT >85，pTM >0.8，聚集倾向低，pI 中性
T2	pLDDT >75，pTM >0.7，可开发性可接受
T3	pLDDT >70，pTM >0.65，存在可开发性方面的顾虑
T4	验证失败或存在重大可开发性问题

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完整性检查清单

• 已获取目标结构（PDB 或预测结构）
• 已识别结合表位
• 已生成 >= 5 个主链，并选出排名前 3-5 个
• 每个主链至少有 >= 8 条序列，并报告 MPNN 分数
• 已验证所有序列（ESMFold），已报告 pLDDT/pTM，且至少 >= 3 条通过
• 已评估可开发性（聚集倾向、pI、表达）
• 已提供候选列表排名、FASTA 文件和实验建议

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参考文件

• DESIGN_PROCEDURES.md - 分阶段代码示例、采样参数、回退链
• TOOLS_REFERENCE.md - 完整工具文档及代码示例
• EXAMPLES.md - 设计工作流和输出示例
• CHECKLIST.md - 详细的分阶段检查清单和质量指标
• design_templates.md - 报告模板和输出格式示例