alterlab-nf-core-sarek

nf-core/sarek — FASTQ 到 VCF 变异检测

从原始 reads 到变异的工作流运行入口：运行 Nextflow nf-core/sarek 流水线（固定为 -r 3.10.0） 处理生殖系或体细胞短读长 FASTQ，完成比对、GATK4 重复标记和碱基质量重校准，以及 SNV/indel 检测，随后将生成的 VCF 交给套件中的数据库和解析技能进行解读。

此技能是套件中基于 Python 库的生物信息学技能的命令行／工作流对应方案。用于原始数据到 VCF 这一步；已有 VCF 后，则使用库技能（alterlab-pysam、alterlab-tiledbvcf）。

何时使用此技能

当用户想要执行以下操作时，触发此技能：

• 从 FASTQ 转到 VCF——对全基因组（WGS）或全外显子组（WES）短读长数据进行变异检测。
• 运行生殖系 SNV/indel 检测（一个或多个正常样本）。
• 运行体细胞／肿瘤-正常检测（配对的肿瘤和正常样本，或仅肿瘤样本）。
• 特别使用 nf-core/sarek，或想要可复现的“GATK 最佳实践比对到 VCF”流水线，而不想手动编写每个步骤。
• 从中间的 --step 恢复运行（已有 BAM/CRAM，只需进行重校准或变异检测）。

不适用——将相关请求转到这里

用户实际想要的是……	转到
在 Python 中解析／筛选／读取已有 VCF/BAM（pysam/htslib）	alterlab-pysam
存储／查询大型多样本变异存储（TileDB-VCF 数组）	alterlab-tiledbvcf
解读已检测变异的临床意义（致病／良性）	alterlab-clinvar
查询已检测变异的人群等位基因频率	alterlab-gnomad
查询体细胞突变目录／癌症普查	alterlab-cosmic
RNA-seq 转录本／基因定量（salmon/kallisto），而不是 DNA 变异	alterlab-rnaseq-quant
16S/ITS 扩增子／微生物组 FASTQ → 特征表	alterlab-qiime2-amplicon
序列同源性／相似性搜索（BLAST+、DIAMOND）	alterlab-blast
空间转录组邻域／SVG 分析	alterlab-squidpy-spatial
根据计数数据进行差异表达统计	alterlab-pydeseq2

如果用户没有工作流引擎，且无法安装 Nextflow 和容器，不要拒绝——改用手动 GATK4 配方（见下文／references/manual_gatk4.md）。

第一大正确性陷阱：sarek 的默认 caller 是 Strelka

根据 3.10.0 用法文档，未设置 --tools 时，sarek 只会运行预处理，然后运行 Strelka。它不会默认使用 GATK HaplotypeCaller 或 DeepVariant。务必显式设置 --tools，以符合用户意图：

意图	传入参数
GATK4 最佳实践生殖系检测	--tools haplotypecaller
最高生殖系 F1（CNN）	--tools deepvariant
体细胞配对肿瘤／正常检测	--tools mutect2（通常为 mutect2,strelka）
跨队列联合生殖系分型	--tools haplotypecaller --joint_germline
GPU 加速的生殖系检测（需要 NVIDIA GPU 配置）	--tools parabricks_haplotypecaller

（根据 3.10.0 架构）--tools 接受：deepvariant、freebayes、 haplotypecaller、parabricks_haplotypecaller、mutect2、lofreq、mpileup、 muse、strelka、sentieon_*、结构变异 caller（manta、tiddit、 indexcov）、CNV／纯度工具（ascat、cnvkit、controlfreec）、质控工具 （ngscheckmate、msisensorpro）、varlociraptor，以及注释工具 （snpeff、vep、snpsift、bcfann）。caller 的选择会显著影响精确率和召回率——参见 references/caller_accuracy.md 中的 nf-core 基准测试（Hanssen 等，2024）。

流水线（如何运行）

1. 构建样本表

sarek 的输入是 CSV。--step mapping 必需的列： patient、sample、lane、fastq_1、fastq_2。可选列：sex（XX/XY， 默认 NA）和 status（0 = 正常，1 = 肿瘤，默认 0）——status 用于告知 sarek 一对样本是否为体细胞样本。

使用辅助工具从 FASTQ 目录生成有效的样本表（它会配对 R1/R2、 填写 lane，并在消耗计算资源前验证架构）：

uv run python skills/bioinformatics/alterlab-nf-core-sarek/scripts/make_samplesheet.py \
    --fastq-dir ./fastq --patient PATIENT_01 --sample TUMOR_01 \
    --status 1 --sex XY --out samplesheet.csv

运行前，追加更多行（例如，使用 --status 0 --append 添加匹配的正常样本）。 所有列、BAM/CRAM 重新输入行和肿瘤-正常示例，请参阅 references/samplesheet_schema.md。

2. 运行流程（固定版本）

nextflow run nf-core/sarek -r 3.10.0 \
    -profile docker \
    --input samplesheet.csv \
    --outdir ./results \
    --genome GATK.GRCh38 \
    --tools haplotypecaller \
    --aligner bwa-mem2

• 始终保留 -r 3.10.0 ——不固定版本的运行会漂移到不同的流程版本。
• -profile 必填：针对本地环境，使用 docker、singularity、apptainer 或 conda （集群还会添加 test、机构配置等）。
• --genome GATK.GRCh38 会选择 iGenomes/GATK GRCh38 参考基因组，并自动使用其 捆绑的 BQSR 已知位点（dbSNP、Mills/1000G indels）。
• --aligner 选项：bwa-mem（默认）、bwa-mem2、dragmap、sentieon-bwamem、 parabricks（GPU）。
• 对于 WES/靶向 panel，同时传入 --wes 和 --intervals targets.bed：--intervals 限定变异检测的区域，而 --wes 会将工具切换为靶向测序设置。未传入 --wes 运行的外显子组数据也会顺利完成， 但会使用针对 WGS 调优的阈值。
• 使用 --step（默认 mapping，之后依次为 markduplicates、 prepare_recalibration、recalibrate、variant_calling、annotate）和 Nextflow 的 -resume，从流程中途恢复运行。

预处理遵循 GATK 最佳实践：比对 → MarkDuplicates → BaseRecalibrator/ApplyBQSR（BQSR）→ 变异检测。详情和所有标志参数： references/usage_3.10.0.md。

3. 解读输出 VCF

各调用工具生成的 VCF 位于 results/variant_calling/<tool>/ 下。然后：

• 使用 alterlab-pysam 解析 / 过滤。
• 使用 alterlab-tiledbvcf 大规模存储 / 查询（多样本）。
• 注释临床意义 → alterlab-clinvar；人群频率 → alterlab-gnomad；体细胞目录 → alterlab-cosmic。

备选方案：手动运行 GATK4（不使用 Nextflow）

如果用户无法运行 Nextflow + 容器，则手动运行等效的 GATK4 最佳实践流程：bwa-mem2 mem → gatk MarkDuplicates → gatk BaseRecalibrator + gatk ApplyBQSR（使用 dbSNP + Mills/1000G 已知 位点）→ gatk HaplotypeCaller -ERC GVCF → gatk GenotypeGVCFs。完整命令 序列和资源包路径见 references/manual_gatk4.md。

报告前自检

• 是否明确设置了 --tools？除非用户确实需要 Strelka，否则绝不要让运行落入其默认设置。
• 是否固定了版本（-r 3.10.0）、选定了 -profile，且 Nextflow 版本是否 >=25.10.4（3.10.0 版本所需）？
• 对于体细胞分析请求，样本表是否包含 status 1 的肿瘤样本 和 同一 patient 下 status 0 的正常样本？
• 对于 WES/靶向 panel，是否同时提供了 --wes 和 --intervals <capture.bed>？
• 运行结束后，是否将 VCF 解读交给了正确的相关技能，而不是在此处重新推导变异含义？

参考资料

• references/usage_3.10.0.md — 固定版本的运行命令、配置方案、--step/--aligner 选项、--wes + --intervals 的搭配、BQSR 预处理；内容源自 3.10.0 使用文档。
• references/samplesheet_schema.md — 完整的 CSV 列规范、BAM/CRAM 重新输入、 肿瘤-正常示例。
• references/caller_accuracy.md — 选择 --tools，总结 nf-core 基准测试（Hanssen et al., 2024, NAR Genomics & Bioinformatics）。
• references/manual_gatk4.md — 不使用 Nextflow 时的 GATK4 最佳实践备选方案。

AlterLab Academic Skills 套件的一部分。