analytical-method-validation

分析方法验证

适用情形

凡是问题涉及分析程序是否适合其预期用途时：设计验证研究、评估验证数据、核实药典程序、将程序转移至另一实验室或仪器，或在报告中为上述任一事项提供依据。

两条规则

1. 设计任何内容之前，先确定适用的框架。 同一种分析方法在 ICH Q2(R2)、USP <1225>、ICH M10、CLSI EP 和 ISO/IEC 17025 框架下的验证方式各不相同。它们对所需特性的规定、研究设计方式，以及是否提供数值验收标准都有差异。混用这些框架会导致方案无法满足其中任何一个框架的要求。

2. 在收集数据之前明确验收标准。 看过结果后才选定的标准不算验收标准，事后决定标准会成为持续存在的审计发现。ICH Q2(R2) 刻意几乎不提供数值标准——这些标准必须来自规格、分析目标概况（ICH Q14 第 3 节）或开发数据。ICH M10 是个例外：它提供了明确的数值，而且色谱分析与配体结合分析的标准有所不同。

范围

此技能用于规划研究、正确计算统计量并组织文档。它不会判定某个程序是否通过验证、放行批次、接受或拒绝某次运行、结束调查，也不能替代分析人员、技术审核人员、质量部门或监管机构。所有脚本只报告；没有任何脚本会作出结论。

版权边界

ICH 指南公开发布，并获准在注明出处的情况下重复使用，因此本技能直接纳入了其中的要求。USP 通则、CLSI EP 文件和 ISO 标准受版权保护，且须付费获取。 对于这些文件，本技能仅提供名称、范围及获取授权副本的方式，绝不提供原文，也不编造阈值。不要要求 Agent 获取、转录或重构这些文件的内容。如果某个数值至关重要，且仅见于付费文件，请查阅授权副本。

框架

cd skills/analytical-method-validation/scripts
python3 plan_validation.py --list-frameworks

Key	适用范围	提供的数值标准
ich-q2r2	原料药和药品的放行与稳定性检测	几乎没有——需自行推导
ich-m10	生物分析浓度测定（PK、TK、BE）	有，并且因分析模式而异
usp-1220	药典程序生命周期，分为三个阶段	需付费获取
usp-1225 / usp-1226	药典程序的验证 / 核实	需付费获取
clsi	临床实验室测量程序（EP 系列）	需付费获取
iso-17025	认可范围内的实验室自建和修改方法	没有——“在必要范围内”

Q2(R2) 于 2023 年 11 月取代 Q2(R1)，并重新调整了各项特性。 范围现为上位特性（第 3.2 节），包含响应（线性）和下限验证（DL/QL）。准确度和精密度归于第 3.3 节，可结合起来依据单一标准进行评估。稳健性作为开发活动处理，并交叉引用 ICH Q14。多变量程序在第 2.5 节和第 3.2.2.3 节中得到明确说明；附录 2 增补了 Q2(R1) 从未涉及的技术示例，包括定量 ¹H-NMR、NIR、定量 LC/MS、qPCR、生物分析法和粒径分析。沿用 Q2(R1) 结构、将线性、范围、准确度、精密度、专属性、LOD、LOQ 和稳健性列为平行项目的方案已经过时。另请注意，2023 年 11 月 30 日发布的错误更正涉及表 5 和表 6–11。

脚本

cd skills/analytical-method-validation/scripts

脚本	回答的问题
plan_validation.py	使用哪种框架、哪些特性、什么研究布局、什么方案？
check_response.py	校准模型在整个范围内是否确实成立？
check_accuracy_precision.py	回收率是多少？变异中有多少来自不同日期？
check_detection_limits.py	按每种允许的方法计算的 DL 和 QL 是多少？它们能否满足报告阈值？
check_bioanalytical_run.py	这次运行是否符合适用于其分析类型的 ICH M10 要求？
compare_methods.py	两种程序是否在预先设定的界限内等效？

所有脚本都接受 --format table|tsv|json。溯源信息、指南引用和注意事项输出到 stderr； 数据输出到 stdout，因此使用 > out.tsv 可将它们分开。退出码为 0 表示未发现问题，1 表示发现问题，2 表示输入错误——因此它们都可以用于工作流门控。

工作流

1. 确定框架和必需特性

python3 plan_validation.py --framework ich-q2r2 --attribute assay --technique hplc --range-use assay

Q2(R2) 表 1 根据测量属性而非技术手段决定所需内容。对于测定：特异性、响应、准确度、重复性、中间精密度。对于限度检查：仅需特异性和 DL。对于鉴别检查：仅需特异性。可接受的属性包括 assay、impurity（定量）、impurity-limit 和 identity。

可报告范围根据规格确定。Q2(R2) 表 2 提供了具体示例——测定为标示含量的 80–120%，含量均匀度为 70–130%，杂质为报告阈值至规格限度的 120%。

2. 生成方案并填写标准

python3 plan_validation.py --framework ich-q2r2 --attribute impurity --protocol > protocol.md

每个方括号字段都是一项需要在数据收集之前作出并记录的决定。方案框架有意不为 Q2(R2) 工作预填接受标准，因为不存在有依据的默认值。

3. 评估响应

python3 check_response.py -i calibration.csv --max-back-calc-error 2

输入格式为 level,response，每次进样一行；同一水平的重复行表示重复测量，只有提供这些数据才能进行线性度检验。

以下是真实曲线的输出，而决定系数会误判这条曲线：

statistic                           value
distinct levels                     5
slope                               166.6000
intercept                           2495.0000
intercept CI includes 0             no
coefficient of determination (r2)   0.9830
lack-of-fit F                       469.5294
lack-of-fit p                       1.5139e-06
runs test p                         0.0492

level     n  mean_response  mean_back_calculated  relative_error_pct
50.0000   2  10075.0000     45.4982               -9.0036
75.0000   2  15150.0000     75.9604               1.2805
100.0000  2  20050.0000     105.3721              5.3721
125.0000  2  24050.0000     129.3818              3.5054
150.0000  2  26450.0000     143.7875              -4.1417

r² = 0.983，但模型不可用：范围下限的反算误差为 −9.0%，失拟 p = 1.5 × 10⁻⁶，残差符号并非随机。r² 不能证明线性——它会随范围增大而上升，且几乎无法反映曲率。失拟 F 检验（与纯误差比较）和残差模式才是证据，因此 Q2(R2) 3.2.2.1 要求分析各点偏离直线的程度，而不能只看相关系数。

对于宽范围曲线，可添加 --weight 1/x2。当范围上三分之一的残差方差超过下三分之一的 10 倍时，脚本会标记异方差；因为在这种情况下，无权重拟合会恰好对报告阈值所在的低端产生偏差。

4. 评估准确度和精密度

python3 check_accuracy_precision.py -i ap.csv --accuracy-limit 2 --rsd-limit 1.0 --design-check assay

输入为 level,measured,group，其中 group 是中间精密度因素——日期、分析人员 或仪器。

level  component                       sd      rsd_pct  df      ci90_low_sd  ci90_high_sd
100    repeatability (within group)    0.0707  0.0707   3       0.0438       0.2065
100    between-group                   1.6515  1.6515   2       n/a          n/a
100    intermediate precision (total)  1.6530  1.6530   2.0037  0.9554       7.2821

重复性为 0.07% RSD，看起来非常出色；但中间精密度为 1.65%，高出 23 倍，因为变异完全发生在不同日期之间。若将日内数据作为该程序的精密度报告，会低估常规表现一个数量级以上。这就是脚本采用单因素随机效应模型，而非合并数据的原因。

脚本会为你处理两个容易踩的坑：

• 精密度按每个水平分别估算，绝不跨水平合并。 将 80/100/120% 的结果合并为一个标准差，会把范围本身也变成表面上的不精密度。脚本按水平分别报告，并额外提供一个与水平无关、以标称值百分比表示的视图。
• --require-ci-within-limit 要求整个置信区间都处于限值内，而不仅仅是均值处于限值内。Q2(R2) 3.3.1.4 要求区间与标准相符；在 6 次重复中勉强达标的均值，并不能证明多少。

5. 确定 DL 和 QL，并予以确认

python3 check_detection_limits.py --calibration lowcal.csv --blanks blanks.csv \
    --confirm-ql 0.05 --confirm-data ql_check.csv --reporting-threshold 0.05

approach                                          sigma   slope      DL      QL
sd-and-slope (sigma = residual SD of regression)  7.2816  5033.3490  0.0048  0.0145
sd-and-slope (sigma = SD of y-intercept)          4.3303  5033.3490  0.0028  0.0086
sd-and-slope (sigma = SD of 8 blanks)             3.7702  5033.3490  0.0025  0.0075

相同数据得出的 QL 估算值相差 1.9 倍，完全是 σ 取值不同造成的。因此，Q2(R2) 3.2.3.5 要求报告限值以及确定限值所用的方法，并用限值附近或接近限值的样品确认估算限值。对于杂质分析程序，QL 必须不高于报告阈值。习惯性地套用 3.3σ/slope、只报告一个未注明方法的数值，以及从不进行确认，是三个独立的缺陷。

6. 按照 ICH M10 进行生物分析批次评估

python3 check_bioanalytical_run.py --modality chromatographic --run run1.csv
python3 check_bioanalytical_run.py --modality lba --isr isr.csv
python3 check_bioanalytical_run.py --modality lba --criteria

--modality 为必填项且没有默认值，因为评估标准确实有所不同：

	色谱法	配体结合分析
校准容差	±15%，LLOQ 处为 ±20%	±20%，LLOQ 和 ULOQ 处为 ±25%
准确度 / 精密度	±15% / ≤15% CV（LLOQ 处为 ±20% / ≤20%）	±20% / ≤20% CV（LLOQ 和 ULOQ 处为 ±25% / ≤25%）
A&P 设计	4 个 QC 水平，每批 5 次重复，至少 3 批，跨至少 2 天	5 个 QC 水平，每批 3 次重复，至少 6 批，跨至少 2 天
总误差	无此标准	≤30%，LLOQ 和 ULOQ 处为 ≤40%
ISR 一致性	至少 2/3 的重复样品在 ±20% 内	至少 2/3 的重复样品在 ±30% 内

将色谱法的 ±15% 标准用于配体结合分析，或将 LBA 总误差标准套用于色谱法，这两种做法都很常见，也都是错误的。

批次检查会落实一项容易遗漏的逐水平规则：所有 QC 中至少 2/3 合格，并且每个水平至少 50% 合格。即使整体合格比例达标，某个水平也可能完全不合格。

finding: QC level high: 0/2 within tolerance (0%); M10 requires at least 50% at each level

7. 转移与方法比较

python3 compare_methods.py -i paired.csv --margin 2 --relative --slope-tolerance 0.05

mean difference (%)                       1.4646
TOST margin                               2.0000
TOST p-value                              1.0528e-13
90% CI (TOST)                             1.44127 to 1.48797
equivalent at stated margin               yes
--- for contrast only ---
paired t-test p (NOT equivalence)         0.0000
OLS slope (biased here)                   1.0396
Deming slope                              1.0398
Passing-Bablok slope                      1.0351

这项脚本检查能避免两个错误：

• “p > 0.05，差异不显著，因此方法等效。” 未能检测出差异并不代表方法等效；在小型转移数据集中，这种结果几乎是必然的。TOST 检验的是关键假设——真实差异是否落在预先设定的界值内。此处，t 检验表明差异高度显著，而且 TOST 表明两种方法在 ±2% 范围内等效；两者都成立，但只有一个回答了问题。
• 使用普通最小二乘法比较方法。 OLS 假设参考值没有误差，而比较两种程序时这一假设并不成立，还会使斜率产生向零偏倚。Deming 回归（需注明误差方差比）和 Passing–Bablok 回归（非参数、抗离群值）才是适当的回归方法；脚本会将它们与 OLS 并列报告，以便对比。

脚本还会标记比例偏倚——即差异随浓度变化的情况。此时，无论均值偏倚和一致性界限看起来多么紧密，都可能产生误导。

此技能旨在防止的问题

1. Q2(R2) 取代 Q2(R1) 三年后，仍按 ICH Q2(R1) 的结构进行验证。
2. 看过数据后才编写验收标准。
3. 将 r² 作为线性证据。
4. 将重复性报告为程序的精密度，却未体现日间变异成分。
5. 只给出一个 DL/QL 数值，却未说明采用的方法，也未进行确认。
6. 将色谱分析的 M10 标准应用于配体结合分析，或反过来。
7. 在方法转移中，将 t 检验结果不显著说成等效。

参考资料

• references/framework-selection.md — 由哪个框架主导，以及用于判断的关键问题
• references/ich-q2r2.md — 结构、表 1 和表 2，以及各特性建议的数据
• references/ich-m10-bioanalytical.md — 色谱分析和 LBA 标准的完整对照
• references/compendial-and-clsi.md — USP、CLSI 和 ISO 的编号、适用范围及引用方式
• references/statistics.md — 统计方法、采用原因及常见错误
• references/source-ledger.md — 此技能中每项主张的出处和研究日期

资源

• assets/validation-protocol-template.md — 提前列明标准的方案结构
• assets/validation-report-template.md — 可追溯至原始数据的报告结构

相关技能

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