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CellProfiler 定量显微成像

当用户需要可重复的 CellProfiler .cppipe、细胞核计数、细胞核荧光或批量显微测量时，请使用此技能。随附的分析流程每个视野接受 一个 2D 灰度 TIFF 细胞核通道，像素为黑即零（MINISBLACK），暗背景上为明亮细胞核。调色板和白色即零的 TIFF 需要显式转换。对于体积分割、多通道细胞 painting 或组织特异性模型，请设计单独的流水线并验证这些假设，而不是静默地投影或拆分图像。

官方应用和手册仍为 4.2.8。PyPI 发布的是 4.2.8.1；此处使用的七个模块以及内嵌的 Threshold 模块与 4.2.8 源码一致，但本次审查未执行该原生发行版。请将辅助环境与 CellProfiler 较旧的依赖栈分开；有关验证边界，请参阅运行时参考。

工作流

1. 确定采集单元：板、孔、位点、时间点（如存在）、像素大小、细胞核通道标识、相机位深、曝光和生物学重复。保留原始图像强度。在使用此辅助工具之前，使用 Bio-Formats 显式转换专有格式。
2. 创建下面的 CSV 清单。image_path 为绝对路径或相对于清单的路径；样本 ID 使用字母、数字、点、短横线或下划线；样本 ID 与板/孔/位点组合唯一。使用非数字样本 ID，例如 sample_001：LoadData 会推断列类型，否则可能将 001 变为 1。避免标识符前后有空白。TIFF 必须为 uint8 或 uint16、单平面/系列/分辨率且非常量。此辅助工具会拒绝 RGB、z-stack 和 float 图像，而不是猜测通道。
3. 使用 assets/nuclei.cppipe 作为起始流水线：LoadData → IdentifyPrimaryObjects → 强度/大小测量 → 轮廓叠加 → CSV 导出。初始直径范围为 8–80 像素，使用全局 Otsu 阈值、无阈值平滑，并排除边界对象。在比较条件之前，请根据代表性图像和采集像素大小校准此范围。
4. 运行一个小型试点，涵盖对照、低/高密度、暗图像和板边缘。检查保存的叠加图，查看是否有遗漏的细胞核、分裂、合并和边缘排除。在 CellProfiler 中调整阈值和去聚簇，导出调优后的 .cppipe，并传递 --pipeline 以保留它。不要为每种处理单独选择设置以使它们的计数一致。
5. 冻结调优后的流水线并分析批次。检查输入饱和警告、零计数、计数/面积分布和对照行为。用于推断的聚合应在生物学重复层面进行；来自一个孔的数千个细胞不是独立的孔。

运行有界实验

在此技能目录中，创建 images.csv：

sample_id,image_path,plate,well,site
control_A01_1,images/control_A01_1_DAPI.tif,Plate1,A01,1

python scripts/nuclei_assay.py prepare images.csv load_data.csv
python scripts/nuclei_assay.py run images.csv results --executable cellprofiler
python scripts/nuclei_assay.py summarize results

run 需要一个全新/空的输出目录，并使用 -c -r、一份保存的流水线副本、--data-file、输出文件夹以及 --done-file 执行 CellProfiler。成功需要退出码为零、一个 Complete 标记以及有效的测量表。它在执行前将命令、流水线校验和、输入图像校验和以及样本 QC 记录到 assay_qc.json，如果执行或输出验证失败，则保留 failed 状态和错误信息。CellProfiler 输出写入 cellprofiler.log。在新的输出文件夹中重新运行。summarize 独立检查 CSV 内容；它并不能证明引擎运行已完成。

自定义流水线必须保留 DNA、Nuclei、Metadata_Sample、整数 dtype 缩放，以及无前缀的单对象 Image.csv/Nuclei.csv 导出契约。保留所需的强度/面积测量。重命名的对象集或不同的强度尺度需要相应的辅助适配，而不是未经检查的 --pipeline 替换。

可执行文件也可以是 CellProfiler 应用程序启动器或本地容器启动器；有关容器目标、文件系统映射和验证证据，请参阅 references/runtime-and-qc.md。prepare 和 summarize 无需 CellProfiler 即可运行。

解读输出

• Image.csv：每个图像/视野一行，包括 Count_Nuclei 和采集元数据。
• Nuclei.csv：每行一个被接受的对象，包含平均/积分 DNA 强度、面积和形状。
• *_nuclei.png：输入图像上的绿色细胞核边界，用于视觉 QC。
• pipeline.cppipe 和 cellprofiler.done：精确的流水线副本和引擎完成标记。
• assay_qc.json：运行状态、唯一图像/对象键、精确计数、有限的平均/积分强度与正面积检查、以像素为单位的视野平均面积，以及存储饱和标志。

在此资产中，LoadData 忽略相机元数据进行缩放，并除以整数存储最大值：uint8 → 255，uint16 → 65535。因此，存储在 uint16 中的 12 位相机的最大值接近 0.0625。在没有明确校准的情况下，不要比较不同位深、曝光、增益或染色批次的强度。饱和图像可能通过分割，但其强度测量不可用。光照校正和背景减除是特定于实验的附加项；此入门工具两者都不做。

饱和比例仅统计处于 存储最大值 的像素。12 位检测器可能在 4095 处饱和，而 uint16 存储最大值为 65535；请单独检查已知的采集上限。积分强度对像素值求和，可能超过 1；只有逐像素平均强度被限制在 0–1。该视野的平均细胞核强度对每个细胞核赋予相同权重，而不是对每个像素赋予相同权重。

计数检查无法证明分割正确。检查叠加图和独立注释的视野；将边界排除和分割错误与生物学结果一起报告。可选的合成引擎测试针对一个已知的三细胞核示例，而不是在未见细胞类型上的实验性能。由于未配置引擎，它在当前审查中被跳过。

来源

• 官方示例流水线：选择一个特定于实验的起点。
• CellProfiler 4.2.8 手册：模块设置与解读。
• 无头批处理：命令行执行。
• 当前应用程序下载 和 PyPI 发行版：不同的发布目标。