glycoengineering

糖工程

适用场景

适用于经典 N-糖基化候选分析、O-GalNAc 候选位点初筛、 抗体糖型比较或结构性糖屏蔽研究。请将四类结果分开记录：序列基序、预测结果、 有实验支持的占据情况，以及糖链结构/组成。任何一类都不能单独确定其余各类。

本工作流聚焦于真核生物分泌通路 N-糖基化与黏蛋白型 O-GalNAc。O-GlcNAc、O-甘露糖、O-岩藻糖及其他 O-连接修饰需要相应的 证据和预测工具；S/T 富集并不能确定修饰类型。

工作流

1. 记录蛋白质登录号、异构体/版本、精确序列、表达宿主、 信号肽/跨膜拓扑结构及构建体边界。保留所提交序列坐标到成熟蛋白、PDB 链/残基 标识符以及相关情况下抗体编号的映射。
2. 扫描经典 N-X-[S/T] 候选位点，其中 X 不为 Pro。保留重叠位点：NNST 在 1 和 2 处起始的位点均存在。缺少经典基序不能排除 非典型 N-糖基化；存在基序也不能确定占据情况。
3. 利用拓扑结构和整理过的证据，优先考虑分泌/腔面/胞外区域。仅凭 序列在胞质区域得到的结果不能作为分泌通路糖基化的证据。
4. 对于 O-GalNAc，仅将 S/T 密度作为描述性特征，随后检查合适的 预测工具及细胞/糖基转移酶背景。不要排除 SP/TP 基序： 相邻的 Pro 可能有利，具体取决于 GalNAc 转移酶和背景。 参见 GalNAc-T 底物研究。
5. 提出明确编号的突变，逐条列出所有改变的残基，并对 全产物重新扫描丢失/新增的重叠基序。在糖基化之外独立评估结构与 表达效应。
6. 通过实验验证占据情况和糖型，需包含定位证据、 糖链组成/结构置信度，以及工程目标所需的生物学检测。对于生物类似药比较，在比较糖链百分比之前，应先匹配样品处理、 分析覆盖范围和定量方法。

本地序列分析

标准库辅助脚本 scripts/glycoengineering_tools.py 可替代复制粘贴的代码片段。使用时，将本技能的 scripts/ 目录置于 PYTHONPATH 中导入，或从该目录运行 Python。它接受原始经典 20 种氨基酸序列，规范化空白/大小写，并拒绝 FASTA 标题、 空位、未知残基和空输入。请先解析 FASTA 记录；不要移除 未知残基，因为这会改变坐标。坐标基于规范化提交序列，从 1 开始计数。

from glycoengineering_tools import (
    normalize_sequence, find_n_glycosylation_sequons,
    eliminate_glycosite, add_glycosite, find_st_rich_sites,
)

sequence = normalize_sequence("NNST")
sites = find_n_glycosylation_sequons(sequence)
assert [site["position"] for site in sites] == [1, 2]

mutant = eliminate_glycosite(sequence, 1, "Q")
assert mutant == "QNST"  # the overlapping sequon at position 2 remains
assert [site["position"] for site in find_n_glycosylation_sequons(mutant)] == [2]

# Three intended changes: A1N, P2A, A3T. P->A must be explicit.
parent = "APA"
product = add_glycosite(parent, 1, "T", allow_proline_substitution=True)
changes = [(i, before, after) for i, (before, after) in
           enumerate(zip(parent, product), 1) if before != after]
assert product == "NAT" and len(changes) == 3

# Density is a fraction of residues, not an O-glycosylation probability.
o_candidates = find_st_rich_sites("STPST", window=7, min_st_fraction=0.4)
assert [site["position"] for site in o_candidates] == [1, 2, 4, 5]

eliminate_glycosite 需要完整的经典糖基化基序，并且进行除 N 之外的 单残基替换。add_glycosite 最多可改变三个残基；它保留 +2 位已有的 S/T。这两个函数都不预测突变体的折叠、糖链占据、 功能或耐受性。N 到 Q 的替换即使没有糖链效应，也可能改变蛋白质行为。

S/T 密度窗口必须为正奇整数。末端窗口会缩短， 其分母为实际窗口长度。密集区域可能有助于初筛 黏蛋白样序列；孤立的真实 O-GalNAc 位点可能会被遗漏。

对于批量分析，保留标识符和规范化序列长度：

sequences = {"overlap": "NNST", "control": "APAA", "mucin_like": "STPST"}
rows = []
for name, raw_sequence in sequences.items():
    seq = normalize_sequence(raw_sequence)
    positions = [site["position"] for site in find_n_glycosylation_sequons(seq)]
    rows.append({"protein": name, "length": len(seq),
                 "n_sequon_positions": positions,
                 "n_sequons_per_100_residues": 100 * len(positions) / len(seq),
                 "st_rich_positions": [site["position"] for site in find_st_rich_sites(seq)]})

预测服务

请使用官方表单，它们接受 FASTA 并返回网页结果；本技能不提供稳定的提交 API 或任务轮询端点。保存 CGI URL 并不等于已提交任务。请将输出、输入和服务版本一并保留。

服务	当前文档所述范围与解读
NetNGlyc 1.0	人类 N-糖基化；报告网络潜能和评审团一致性。默认阈值 0.5；并非经过校准的占据概率。最多 2,000 条序列 / 总计 200,000 个残基 / 每条序列 4,000 个残基。会运行 SignalP，但不检查胞外拓扑。该服务可能对 N-P-S/T 打分；除非有独立证据支持复核，否则应将这些从规范候选集中排除。
NetOGlyc 4.0	哺乳动物黏蛋白型 O-GalNAc；输出 GFF2 置信度分数，分数大于 0.5 的标记为阳性。最多 50 条序列 / 总计 200,000 个残基 / 每条序列 4,000 个残基。优先使用包含信号肽的完整序列；孤立位点需要两侧各 15 个残基的侧翼上下文。阳性结果支持区域可能性，并不保证位点占据，也不保证超出本模型 O-GalNAc 范围的聚糖类型。

已审阅服务文档和示例输出；本次刷新期间未提交新的预测任务。

使用 GlycoSHIELD 进行结构屏蔽

GlycoSHIELD 将预先模拟的聚糖构象嫁接到蛋白质结构上，并过滤空间冲突。它不预测哪些序列子被占据，也不为每个查询运行新的分子动力学。参见 Tsai et al., 2024。

阅读 references/glycoshield.md 了解固定版本的源码、安装、直接 Python API、输入映射和 SASA 分析。经审阅的上游命令行会静默忽略若干已解析的选项，包括 --mode、--threshold 和 --dryrun；请使用文档所述的直接 API 变通方法。 输出包括每个位点的 PDB/XTC 系综以及编码在 PDB B-factor 列中的屏蔽信息；这些值不是晶体学温度因子。

数据库证据与聚糖表示法

阅读 references/glycan_databases.md 了解实时 GlyTouCan SPARQL 查询、GlyConnect 访问限制、精选资源和表示法。查询确切的登录号，并保留数据集/来源日期、物种、组织/细胞背景以及支持性出版物。记录缺失或服务错误不能证明某蛋白质未糖基化。

诸如 Hex:5 HexNAc:4 dHex:1 的单糖组成无法解析连接方式、分支位置，也无法区分 GlcNAc 与 GalNAc。没有连接信息的示意图只是示意性的，并非 IUPAC 缩合表示法。在可用时，请使用实际序列（WURCS/GlycoCT/IUPAC，并保留其不确定性）和登录号。核心岩藻糖连接到 N-聚糖最内侧的 GlcNAc，而非核心甘露糖。

抗体工程决策

在明确的编号方案（通常为 EU）中对抗体 Fc 突变进行编号，然后将其映射到实际构建体。EU N297 并非分离的 Fc FASTA 中的第 297 位残基。Fc 聚糖与任何 Fab 聚糖必须在分析上加以区分。

目标	候选策略	所需解读
增强 FcγRIIIa 结合 / ADCC	在保留聚糖的同时降低 Fc 核心岩藻糖化	效应大小取决于抗体、受体和检测方法；不要假定存在普遍一致的倍数增益。结构证据。
移除经典 Fc N-糖基化	N297Q/A/D，或用 T299A 破坏 +2 位残基	序列子破坏；并不能保证结构或效应功能在其他方面保持不变。请验证实际产物。
改变血清持久性	使用相关蛋白表征糖型特异性清除	IgG 高甘露糖清除可能加快；唾液酸化并非通用的 IgG 半衰期配方。人体 PK 研究。
研究抗炎性 Fc 活性	比较明确的唾液酸化糖型	连接方式、制备方法和生物学模型都很重要。特定模型中的阳性结果并不能确立通用的 IVIG 机制。明确 Fc 研究。
减少非人聚糖表位	测量 α-Gal 和 Neu5Gc，并选择兼容的生产条件	仅靠序列编辑无法控制宿主的聚糖加工。
研究表位可及性	引入或移除已定位的表面序列子	确认占据情况、折叠、结合和抗原性；屏蔽计算只是几何假设。

诸如 S298A/E333A/K334A 或含 F243L 的组合等 Fc 序列变体，既可改变受体相互作用，也可改变宿主依赖性的聚糖加工。不要将单独的 F243L 标记为确定性的去岩藻糖化开关。参见 2026 Fc 变体聚糖研究。

实验解读与验证边界

糖肽搜索可支持肽段身份、组成，有时还可支持位点定位，但无法解析完整的聚糖结构。请审查定位碎片、竞争性归属、搜索空间选择和错误控制。在 Byonic 中，组成并不决定拓扑结构；即使已鉴定出糖肽，O-糖基化位点的模糊性仍可能存在。检测到的各糖型之间的相对信号并不自动等同于绝对位点占据率；占据率需要适当的修饰与未修饰分母，以及分析响应方面的考量。

局部序列行为已通过合成测试覆盖。公共登录号查询已执行；API 错误处理为模拟。GlycoSHIELD 的源代码/参数处理已检查，但完整的构象体移植、GROMACS SASA、DTU 任务、商业 MS 软件和生物学性能均未执行。支持性参考文献记录了服务/来源审查日期以及未解决的可访问性缺口。