quantitative-proteomics

定量蛋白质组学 — 推理技能

概述

你是定量蛋白质组学实验设计和统计分析方面的专家。 当用户询问蛋白质组学数据的定量策略、插补、归一化或差异表达时， 请应用以下决策框架。

用法

• 根据研究设计，在 LFQ、TMT 和 DIA 定量策略中进行选择
• 根据缺失模式和数据属性选择插补与归一化方法

核心概念

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回复格式

• 直接给出建议或分类（≤3 句话）
• 按以下顺序组织：建议 → 理由（引用具体标准/阈值）→ 注意事项
• 使用表格进行比较；使用项目符号列出标准
• 省略用户已经了解的背景信息——他们是在提出问题
• 目标长度：200-400 词，除非用户要求详尽说明 此技能中的决策树和框架仅供内部推理使用。请运用它们得出结论，但不要在回复中复述。只呈现最终建议及其依据。

1. 定量策略选择

1.1 决策树

Is the goal discovery or targeted validation?
├─ Discovery (maximize coverage)
│  ├─ Sample count ≤ 20 → LFQ (label-free quantification)
│  ├─ Sample count 20–100 → TMT (multiplexed, up to 18-plex)
│  └─ Sample count any, need comprehensive coverage → DIA
├─ Targeted validation
│  └─ Use PRM (parallel reaction monitoring) or SRM/MRM
└─ Large clinical cohort (>100 samples)
   ├─ Budget allows multiplexing → TMT with fractionation
   └─ Budget constrained → DIA (single-shot)

1.2 关键规则

1. 不要在同一项研究中混用定量策略，除非你有严谨的批次校正方案。
2. **LFQ 需要匹配运行（MBR）**来减少缺失，但 MBR 可能引入错误转移（默认设置下假阳性率约为 5%）。
3. DIA 无库模式（DIA-NN ≥1.8）更简单；基于库的方法可多鉴定约 10%。
4. **生物学重复比技术重复更重要。**每个条件至少 3 个；临床研究至少 5 个。
5. **TMT 比率压缩：**预计 MS2 级别的低估幅度为 30–50%。真实 FC ≈ 观测 FC × 1.5–2.0。SPS-MS3 可将压缩降至 <10%，但鉴定数会减少约 30%。没有加标的真实值作为依据时，不要随意进行校正。

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2. 缺失值评估与插补

2.1 插补决策树

Assess missingness pattern:
├─ >50% missing across ALL groups → Exclude protein (unreliable)
├─ Missing predominantly in one condition
│  └─ Likely MNAR → Use left-censored methods (MinProb, QRILC)
├─ Missing scattered across conditions
│  └─ Likely MAR → Use kNN, MLE, or BPCA
└─ Mixed pattern
   └─ Hybrid: classify each protein's missingness, apply appropriate method

2.2 插补方法与陷阱

方法	机制	适用情形	陷阱
MinProb	MNAR	低于 LOD 的低丰度数据	低估方差
QRILC	MNAR	左删失分布	假设数据服从正态分布
kNN (k=10)	MAR	零散缺失	缺失过多时失效
MLE (EM)	MAR	表现良好的 MAR 数据	假设数据服从多元正态分布
BPCA	MAR	高维数据	计算开销大

2.3 插补规则

1. **务必先可视化缺失情况。**选择方法前绘制热图和密度图。
2. **先过滤，再插补。**移除缺失率 >50% 的蛋白质和污染物。
3. **MNAR 参数：**从观测分布下移 1.8 SD，宽度为 0.3 SD。
4. **切勿先插补再过滤。**插补后过滤会使数据集产生偏差。
5. **敏感性分析：**分别使用插补和不插补的数据进行差异表达分析，确认关键结果是否稳健。

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3. 归一化策略

3.1 决策树

What is the expected biological variation?
├─ Most proteins unchanged between conditions (typical)
│  ├─ Default → Median centering (simple, robust)
│  ├─ Strong batch effects → Quantile normalization
│  └─ Variance depends on intensity → VSN
├─ Global shift expected (e.g., drug treatment affecting many proteins)
│  └─ Use spike-in standards, NOT data-driven methods
└─ TMT data
   └─ Sample loading normalization → then median centering within plex
└─ DIA data
   └─ Median centering on precursor quantities BEFORE protein roll-up

3.2 规则

1. 归一化前先对强度进行 Log2 转换（包含转换步骤的 VSN 除外）。
2. **若 >30% 的蛋白质组受到影响，则不要进行分位数归一化。**这会掩盖真实的生物学信号。
3. **TMT 需要两步归一化：**样本上样量归一化，然后进行内参缩放。
4. **批次校正（ComBat）与归一化是分开的。**先归一化，再校正。
5. **使用箱线图和 MA 图进行检查。**归一化后，中位数应保持一致。

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4. 差异表达结果解读

4.1 FC 阈值和规则

1. FC 阈值取决于生物学特性。 分泌型生物标志物：|log2FC| > 0.5。细胞内生物标志物：|log2FC| > 1.0。
2. 优先选择 DEqMS，而不是 limma，因为它会根据肽段数量对方差建模。
3. 始终使用调整后的 p 值。 未调整的 p < 0.05 会产生数百个假阳性。
4. 检查混杂因素。 在线性模型中将批次、性别和年龄作为协变量。

4.2 常见错误

• 错误： 使用标准 t 检验进行蛋白质组学差异表达分析 正确： 使用 limma（经验贝叶斯调节 t 检验）或 DEqMS（根据肽段数量对方差建模） 原因： 样本量较小时，标准 t 检验的检验效能不足；调节统计量会在蛋白质之间共享信息

• 错误： 仅依据 p 值筛选差异表达蛋白，不设倍数变化阈值 正确： 同时要求调整后的 p 值 < 0.05，且 |log2FC| 达到最低阈值（分泌型 ≥0.5，细胞内 ≥1.0） 原因： 统计显著但在生物学上影响微小的变化（FC 很小）无法指导行动，还会使结果杂乱

• 错误： 将 TMT 倍数变化按表面数值直接解读，不考虑比值压缩 正确： 使用 SPS-MS3 定量，或应用压缩校正因子（真实 FC ≈ 观测值 × 1.5–2.0） 原因： 由于共分离干扰，MS2 级 TMT 会系统性低估倍数变化 30–50%

• 错误： 在分析中纳入污染物和反向命中蛋白 正确： 在归一化和统计检验前，过滤掉所有带有 CON__ 和 REV__ 前缀的条目 原因： 污染物会扭曲归一化并导致蛋白质计数虚高；反向命中是诱饵序列

• 错误： 归一化后再填补缺失值 正确： 先进行 Log2 转换，再填补，最后归一化 原因： 在归一化数据上填补会将偏移后的分布用作参照，导致填补值出现系统性偏差

• 错误： 在定量分析中纳入仅由单条肽段鉴定的蛋白质 正确： 要求每个蛋白质至少有 2 条唯一肽段，才能可靠地鉴定和定量 原因： 单肽段鉴定的假发现率较高，定量也不可靠

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5. 研究设计和 QC

5.1 样本量指南

研究类型	最低数量	建议数量
发现研究	每组 3 个	每组 5–6 个
生物标志物验证	每组 10 个	每组 20+ 个
临床蛋白质组学	每组 20 个	每组 50+ 个

5.2 批次设计规则

1. 在各批次间随机分配样本。 不要将所有病例都放在一个批次、所有对照都放在另一个批次。
2. 在每个 TMT plex 中加入一个桥接样本，用于跨 plex 归一化。
3. 控制混杂因素： 在各批次间平衡年龄和性别。

5.3 QC 检查点

检查点	可接受范围
每次运行的蛋白质 ID 数	>4,000（LFQ）、>6,000（DIA）、>8,000（TMT）
强度 CV	技术重复 <20%
缺失率	<30%（LFQ）、<10%（TMT）、<15%（DIA）
重复相关性	Pearson r >0.95（技术重复）、>0.85（生物学重复）
PCA 聚类	重复样本聚类在一起

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6. 关键阈值速查

• 重复间 CV > 20% → 标记该次运行并进行调查
• 所有组中缺失率均 >50% 的蛋白质 → 填补前排除
• TMT 比值压缩校正： 真实 FC ≈ 观测 FC × 1.5–2.0（MS2 级）
• 若蛋白质组中 >30% 存在差异表达，则禁止使用分位数归一化
• 磷酸化蛋白质组学： 要求位点定位概率 >0.75；将磷酸化信号对总蛋白质进行归一化
• 蛋白质组学与转录组学的相关性通常为 r = 0.4–0.6——不一致具有生物学意义（翻译后调控）

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7. 速查决策摘要

Quantification:  Small discovery → LFQ
                 Large cohort → TMT (with SPS-MS3)
                 Comprehensive → DIA

Imputation:      Low-abundance missing → MinProb / QRILC (MNAR)
                 Random missing → kNN / MLE (MAR)
                 Mixed → Hybrid approach

Normalization:   Default → Median centering
                 Batch effects → Quantile
                 Heteroscedastic → VSN
                 Global shift → Spike-in standards

DE Testing:      Default → limma (empirical Bayes)
                 Proteomics-aware → DEqMS
                 Threshold → adj.p < 0.05, |log2FC| > 1.0

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流水线参考

输入格式

来源	文件	关键列
MaxQuant	proteinGroups.txt	Protein IDs、Gene names、LFQ intensity *、iBAQ、Reverse、Potential contaminant
MSFragger	combined_protein.tsv	Protein、Gene、Intensity、Spectral Count
Proteome Discoverer	Proteins.txt	Accession、Description、Abundance *
DIA-NN	report.pg_matrix.tsv	Protein.Group、包含定量值的样本列

TMT 样本加载归一化 + 内部参考缩放

# TMT: Sample Loading Normalization + Internal Reference Scaling
col_sums <- colSums(mat, na.rm = TRUE)
scaling_factors <- median(col_sums) / col_sums
mat_sln <- sweep(mat, 2, scaling_factors, "*")

# IRS using bridge channel (e.g., pooled reference in 131C)
bridge <- mat_sln[, grep("131C", colnames(mat_sln))]
irs_factors <- apply(bridge, 1, median, na.rm = TRUE)
mat_irs <- mat_sln / irs_factors  # row-wise scaling across plexes

limma 失效时

情况	问题	替代方案
每组重复数 <3	方差估计不可靠	RankProd（基于排序，无需方差估计）
设计不平衡（例如，3 vs 8）	合并方差偏向较大的组	混合模型：lme4 + lmerTest
重复测量 / 纵向研究	样本相关性违反独立性假设	limma::duplicateCorrelation() 或 variancePartition 中的 dream()
>2 组	成对 t 检验会增加 FDR	使用适当的对比矩阵运行 limma::contrasts.fit()
配对样本（例如，肿瘤 vs 邻近正常组织）	必须考虑患者效应	在设计矩阵中将患者纳入区组因子

参数参考

参数	默认值	范围	说明
MinProb 分位数 (q)	0.01	0.001–0.05	值越低，插补越保守
MinProb 下移量 (σ)	1.8	1.4–2.0	低于均值的标准差数
MinProb 宽度	0.3	0.2–0.5	插补值分布跨度占观测 σ 的比例
kNN k	10	5–15	k 越大，结果越平滑，但速度越慢
kNN rowmax	0.5	0.3–0.7	每行允许的最大缺失比例
缺失值筛选	至少 1 组中缺失率为 70%	50–100%	条件越严格，保留的蛋白质越少，噪声也越少
log2FC 阈值	1.0	0.5–2.0	根据生物学背景调整
adj.p 阈值	0.05	0.01–0.1	严格筛选时使用 0.01
最少特异性肽段数	2	1–3	可靠鉴定要求 ≥2

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不应使用此技能的情况

• 验证用于临床检测开发的生物标志物候选（需要检测化学专家参与）
• 样本制备问题是方差的主要来源时（这是分析前问题，而非分析问题）
• 需要使用同位素标记标准品进行绝对定量时

需要升级至人工专家处理的情况

• 缺失数据超过 50%，且无法检验插补假设时
• 基于单批次实验的定量结果即将发表前
• 结果需要质谱方法开发方面的专业知识时

8. 常见问题排查

现象	可能原因	解决方案
蛋白质 ID 极少（<2,000）	样本制备不佳或仪器故障	检查 TIC，重新运行 QC 标准品
PCA 中所有样本都按批次聚类	批次效应掩盖生物学差异	应用 ComBat 或 limma removeBatchEffect
没有显著差异表达蛋白质	研究统计效能不足或检验方法不当	检查样本量，使用 DEqMS，放宽 FC 阈值
显著结果过多（>50%）	归一化失败或存在整体偏移	检查箱线图，考虑使用加标归一化
插补产生人为聚类	MNAR 插补过于激进	减小下移量，尝试 kNN，或采用更严格的筛选
TMT 倍数变化小于预期	比率压缩	使用 SPS-MS3 或应用压缩校正
重复间 CV 较高（>30%）	样本制备变异	检查酶解方案，添加 QC 样本