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ACMG/AMP 变异分类

ACMG 推理

每项标准（致病性标准 PS、PM、PP；良性标准 BS、BP）都会提供一份有权重的证据，用于支持或反对致病性。分类取决于所有已触发标准的组合，而非任何单项标准。不要过度看重单一发现。

标准层级为：PVS1（极强）> PS（强）> PM（中等）> PP（支持）。良性标准方面：BA1（独立）> BS（强）> BP（支持）。在对功能缺失不耐受的基因中，移码变异（PVS1）加上 ClinVar 专家小组判定为致病的记录（PS1），可归类为致病。单独一项 PP 标准则不够。关键在于组合规则。

需要避免两个常见错误：（1）看到 ClinVar 中的“Pathogenic”条目就停止分析——如果未经专家小组审核，这属于 PP5（支持），并非自动确认；（2）因为某个预测工具判定“tolerated”就排除某个变异——预测结果不一致意味着 PP3 和 BP4 均不适用，这是中性证据，而非良性证据。

始终保守地应用标准。证据存在歧义时，不要认定该标准满足。每项已启用标准都要注明来源，以便临床医生审核推理过程。

关键原则：

1. 以标准为依据——注明启用了哪些标准及原因
2. 保持保守——证据有歧义时，不要提高标准等级
3. 考虑基因特性——根据基因机制（功能缺失或功能获得）调整阈值
4. 按人群校准——使用 gnomAD 中特定祖源的频率，而不只是全局 AF
5. 保持透明——展示每项标准对应的证据
6. 注明来源——启用每项标准时，都必须注明数据库或工具来源
7. 优先使用英语查询——在工具调用中始终使用英语术语；使用用户的语言作答

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查询，不要猜测

对任何科学事实存在疑问时，应先查询数据库（PubMed、UniProt、ChEMBL、ClinVar 等），而不是依赖记忆进行推理。经数据库核实的答案始终比猜测更可靠。

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适用场景

• “使用 ACMG 标准对 BRCA2 c.5946delT 进行分类”
• “这个 VUS 是否致病？NM_000059.4:c.7397T>C”
• “对 rs28897743 应用 ACMG 指南”
• “CFTR p.Arg117His 的致病性如何？”
• “TP53 R248W 的 ACMG 分类”

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工具参数参考

工具	关键参数	备注
VariantValidator_validate_variant	variant_description、genome_build、select_transcripts	genome_build="GRCh38"
VariantValidator_gene2transcripts	gene_symbol	返回 MANE Select 转录本
Tark_get_mane_transcripts	gene（或 ensembl_id/refseq_id）	Ensembl Tark MANE Select/Plus Clinical，包含 ENST↔RefSeq 配对；用于轻量级核对规范转录本命名空间
Tark_get_transcript	stable_id（例如 "ENST00000380152"）	存档的转录本记录（组装版本、生物类型、坐标、各版本号），用于解析特定的转录本版本
MyVariant_query_variants	query	HGVS 或 rsID。返回 ClinVar、gnomAD、CADD、REVEL、SIFT、PolyPhen
EnsemblVEP_annotate_hgvs	hgvs_notation	后果、共定位变异、按祖源划分的 gnomAD 数据
gnomad_search_variants	query	将 rsID 转换为 gnomAD 变异 ID
gnomad_get_variant	variant_id	按祖源划分的人群频率
gnomad_get_gene_constraints	gene_symbol	pLI、LOEUF、mis_z
ClinVar_search_variants	query	响应格式不固定：列表或 {status, data}
ClinVar_get_variant_details	variant_id	ClinVar 数字 ID
civic_get_variants_by_gene	gene_id	CIViC 数字基因 ID（不是 symbol）。已知：BRAF=5、BRCA2=19
UniProt_get_function_by_accession	accession	返回字符串列表
InterPro_get_entries_for_protein	accession	按 UniProt accession 查询结构域架构
alphafold_get_prediction	qualifier	UniProt accession；pLDDT 置信度
PubMed_search_articles	query、limit	返回字典列表
MyGene_query_genes	query	按 symbol 匹配进行筛选（首条结果可能不匹配）

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阶段 0：变异验证与标准化

HGVS 错误或转录本错误会导致后续所有标准的判断都出现连锁错误。先进行验证。

1. 获取 MANE Select 转录本：VariantValidator_gene2transcripts(gene_symbol="BRCA2")。使用 Tark_get_mane_transcripts(gene="BRCA2") 核对规范转录本（返回 ENST↔RefSeq 配对，例如 ENST00000380152.8 / NM_000059.4）；需要确定特定转录本版本时，使用 Tark_get_transcript(stable_id="ENST00000380152")。
2. 验证变异：VariantValidator_validate_variant(variant_description="NM_000059.4:c.5946delT", genome_build="GRCh38", select_transcripts="mane_select")
3. 解析基因 ID：MyGene_query_genes(query="BRCA2") — 提取 Ensembl ID 和 UniProt accession。按 symbol == 'BRCA2' 筛选结果（首条结果可能不匹配）。
4. 记录：HGVS 编码变异、HGVS 蛋白变异、基因组坐标、变异类型（移码/错义/无义/剪接/同义/非移码插入缺失）。

接受的输入：HGVS 编码变异（NM_000059.4:c.5946delT）、HGVS 蛋白变异（BRCA2 p.Val600Glu）、rsID（rs28897743）、基因+变异（BRCA1 c.68_69del）、基因组坐标。

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阶段 1：人群频率（BA1、BS1、BS2、PM2）

人群 AF 是支持任一方向判断的最有力证据之一。任何人群中频率超过 5% 的变异几乎肯定是良性的（BA1 — 独立标准，无需进一步分析）。在 gnomAD 中未检出支持致病性（PM2；根据 ClinGen 指南，目前通常作为 PM2_Supporting 应用）。

应使用祖源特异性 AF，而不只是全局 AF。某变异在东亚人群中的频率为 8%，但在全球范围内较罕见，那么在该祖源背景下它是良性的。BS1 的阈值取决于疾病患病率和遗传方式——常见疾病的默认值为 1%，罕见疾病为 0.1%。

gnomad_search_variants(query="rs28897743")          # get gnomAD variant ID
gnomad_get_variant(variant_id="...")                 # per-ancestry frequencies
gnomad_get_gene_constraints(gene_symbol="BRCA2")     # pLI, LOEUF, mis_z
MyVariant_query_variants(query="rs28897743")          # fallback: gnomad_genome.af

如果没有 gnomAD 数据，请注明这一缺口并继续——没有数据不等同于存在缺失证据。

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阶段 2：计算预测（PP3、BP4）

没有任何单个预测工具能给出确定结论。判断依据是：多个独立预测工具的结果一致，可作为支持性证据。结果不一致时，PP3 和 BP4 均不适用——这属于中性，而非良性。

当多数预测工具一致认为变异有害时，或仅 REVEL >= 0.7（根据 ClinGen 指南已足够）时，适用 PP3（支持致病）。只有所有预测工具均一致认为变异良性，或 REVEL < 0.15 或 CADD < 15 时，才适用 BP4（支持良性）。这些标准仅适用于错义变异。

MyVariant_query_variants(query="...")        # REVEL, CADD PHRED, AlphaMissense, SIFT, PolyPhen
EnsemblVEP_annotate_hgvs(hgvs_notation="...") # consequence, SpliceAI deltas

对于非错义变异，跳过 PP3/BP4，并在阶段 5 中重点评估 SpliceAI 分数。

VUS 解析叙述中的机制补充：PP3/BP4 是对预测分数的计票——它说明变异是否有害，而非如何有害。对于需要提供机制解释的 VUS 解析报告（临床医生问“为什么这种变异有害？”），可添加 ESM_explain_variant_mechanism(sequence=..., position=..., ref_aa=..., alt_aa=...)——它会返回 ESMC-6B SAE 特征类别的丢失/新增情况（催化 / 配体结合 / ptm / 结构稳定性 / 结构域 / 等），并附上一句摘要。这不会改变 PP3 的证据强度，但能将“符合 PP3（REVEL 0.78，AlphaMissense 0.85）”转化为“符合 PP3——且 SAE 显示位置 X 的催化特征丢失，与活性位点受损相符。”需要 ESM_API_KEY；仅适用于错义变异。

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阶段 3：临床数据库证据（PS1、PM5、PP5、BP6）

ClinVar 汇总临床实验室的分类结果。判断依据是：如果相同的氨基酸改变（由不同核苷酸导致）已被确认为致病，这是强有力的证据（PS1），因为其作用机制在于氨基酸改变。如果同一残基上发生了不同的致病错义变异，则属于中等强度证据（PM5）——这说明该残基具有重要功能。

当 ClinVar 显示致病且复核等级 >= 2 星时，适用 PP5（已提供标准，且有多个提交者）。根据意见一致的提交者数量确定权重。ClinVar 解释相互冲突时，不应适用 PP5 或 BP6。ClinGen 曾建议降低 PP5/BP6 的权重——应将其视为支持性证据，而非强证据。

ClinVar_search_variants(query="BRCA2 c.5946delT")
ClinVar_get_variant_details(variant_id="...")
civic_get_variants_by_gene(gene_id=19)   # BRCA2 CIViC ID is 19

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阶段 4：功能结构域与蛋白质分析（PM1、PP2、BP1）

位于已明确的功能结构域、且该结构域中已知致病变异富集的变异，更可能致病。PM1（中等强度致病证据）要求变异位于良性变异较少的热点结构域——使用 InterPro 结构域架构以及 UniProt 活性位点/结合位点进行评估。

PP2 和 BP1 互斥。对于错义变异，如果所在基因的已知致病机制为错义变异，且良性错义变异率较低（mis_z > 3.09），则适用 PP2（支持致病）。如果所在基因仅由截短变异导致疾病（仅 LOF 机制），则适用 BP1（支持良性）——此类基因中的错义变异不太可能致病。

UniProt_get_function_by_accession(accession="P51587")        # active sites, binding sites
InterPro_get_entries_for_protein(accession="P51587")          # domain architecture
alphafold_get_prediction(qualifier="P51587")                   # pLDDT > 90 = structured region
gnomad_get_gene_constraints(gene_symbol="BRCA2")              # mis_z for PP2/BP1

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阶段 5：剪接影响评估（PVS1）

PVS1 是单项证据中最强的致病标准。在 LOF 已确认为致病机制的基因中，无功能变异（无义 / 移码 / 经典剪接位点 / 起始密码子）可触发 PVS1，但其完整证据强度取决于具体情况。

满足以下条件时，按完整强度应用 PVS1：无功能变异 + LOF 是已知机制 + 变异不在末外显子或倒数第二个外显子的最后 50bp 内 + 不存在可补偿的转录本。如果变异位于末外显子或可能逃逸 NMD，则降级为 PVS1_Moderate。如果可能存在可补偿的转录本，或 SpliceAI >= 0.5 但变异不在经典剪接位点，则降级为 PVS1_Supporting。如果 LOF 机制尚不确定，则不要应用 PVS1。

EnsemblVEP_annotate_hgvs(hgvs_notation="...")   # splice_donor_variant, splice_acceptor_variant
MyVariant_query_variants(query="...")             # SpliceAI deltas
gnomad_get_gene_constraints(gene_symbol="...")    # pLI >= 0.9 or LOEUF < 0.35 = LOF intolerant

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阶段 6：文献与功能证据（PS3、BS3、PP1、PP4）

设计完善的功能实验若显示功能缺失（LOF）（PS3）或功能正常（BS3），可显著影响分类。对于严谨性较低的实验，可降低 PS3/BS3 的等级（例如，PS3_Supporting）。并非所有功能实验都符合要求——ClinGen 的基因特异性指南会界定有效实验。

PP1（共分离）在 >= 7 次信息性减数分裂时升级为 PP1_Strong。若患者表型对该基因相关疾病具有高度特异性，则适用 PP4。

PubMed_search_articles(query="BRCA2 c.5946delT functional assay", limit=10)
PubMed_search_articles(query="BRCA2 c.5946delT segregation family", limit=5)

需要临床数据的标准（PS2、PS4、PM3、PM6、BS4、BP2、BP5）无法自动评估。除非用户提供临床背景，否则应记录为“未评估”。

PM4（非重复区域中的蛋白质长度变化）和 BP3（重复区域中的框内插入缺失）可根据变异类型进行部分评估。BP7（同义变异，且不影响剪接）可通过 SpliceAI < 0.1 进行评估。

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自动交叉核验（InterVar）

阶段 0–6 的所有内容都是人工逐条标准评估，并附有引用——这是此技能的核心价值，应继续作为主要输出。InterVar_classify_variant 会在服务器端根据裸基因组坐标运行等效的 ACMG/AMP 2015 标准，并通过一次调用返回分类以及全部 28 项标准的激活状态。可将其用作快速独立交叉核验，检查你自己的人工判定，但绝不能以此取代人工评估——人工流程会为每项标准引用来源；InterVar 不会。

工具	关键参数	响应字段
InterVar_classify_variant	chrom、pos、ref、alt（默认使用 GRCh37/hg19；传入 build="hg38" 则使用 GRCh38），全部必填	data.classification、data.active_criteria[]（例如 ["PS3","PM1","PM2","PP3","PP5"]）、全部 28 个代码对应的 data.criteria_detail.<CODE>.active（布尔值）

交叉验证示例，已实时验证：TP53 chr17:7674220 C>T（GRCh38；也是 tooluniverse-variant-analysis 中用于 GeneBe/ClinGen 交叉核验的同一变异）返回 classification="Pathogenic"，且 PS3+PM1+PM2+PP3+PP5 处于激活状态——与 GeneBe 对同一变异给出的独立“Pathogenic”判定一致。两个独立实现的 ACMG 分类器得出一致结果，正是报告中值得引用的佐证；如果结果不一致，应将其视为重新检查人工评估标准的理由，而不是默默优先采用其中某个工具的答案。

已知的数据质量问题，已实时验证，并非猜测：该工具自身的 JSON description 字段声称，其第一个演示示例（chrom="17", pos=41245466, ref="G", alt="A"，标注为“BRCA1 c.5266dupC”）会以 PM2+PP3+PP5 分类为“Likely Pathogenic”。但实时 API 实际返回 classification="Benign"，且 BA1+BP4+BP6+BP7+BS1+BS2 处于激活状态。这是预期结果，并非工具缺陷：c.5266dupC 是单碱基重复（插入），无法用 ref="G"/alt="A" 的替换表示——示例中的坐标本身并未编码其标签所声称的移码，因此“Benign”结果是 InterVar 对实际收到的 SNV 正确分类，并非错误分类了 BRCA1 c.5266dupC。切勿不经实时核验就相信工具文档中的演示示例；务必传入编码正确的变异。

分类算法

将各项标准按其应用后的强度组合（升级或降级后）：

致病：（1）PVS1 + ≥1 项强证据；（2）PVS1 + ≥2 项中等证据；（3）PVS1 + 1 项中等证据 + 1 项支持证据；（4）PVS1 + ≥2 项支持证据；（5）≥2 项强证据；（6）1 项强证据 + ≥3 项中等证据；（7）1 项强证据 + 2 项中等证据 + ≥2 项支持证据；（8）1 项强证据 + 1 项中等证据 + ≥4 项支持证据

可能致病：（1）PVS1 + 1 项中等证据；（2）1 项强证据 + 1-2 项中等证据；（3）1 项强证据 + ≥2 项支持证据；（4）≥3 项中等证据；（5）2 项中等证据 + ≥2 项支持证据；（6）1 项中等证据 + ≥4 项支持证据

良性：（1）BA1 单独成立；（2）≥2 项良性强证据

可能良性：（1）1 项良性强证据 + 1 项良性支持证据；（2）≥2 项良性支持证据

意义未明变异：未达到上述任何阈值，或致病与良性证据相互冲突。

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输出格式

# ACMG Variant Classification Report

## Variant: [HGVS]
- **Gene**: [symbol] | **Transcript**: [MANE Select] | **Protein**: [p.notation] | **Type**: [variant type]

## Classification: [PATHOGENIC / LIKELY PATHOGENIC / VUS / LIKELY BENIGN / BENIGN]

## Evidence Summary
### Pathogenic Criteria Met
| Criterion | Strength | Evidence | Source |

### Benign Criteria Met
| Criterion | Strength | Evidence | Source |

### Criteria Not Met (key ones with reasoning)
### Criteria Not Assessed (and why)

## Detailed Evidence
- Population: gnomAD AF, ancestry max, homozygotes, gene constraints
- Computational: predictor concordance
- Clinical: ClinVar classification + review status, CIViC entries
- Domain: InterPro domains, UniProt annotations
- Splice: SpliceAI scores, canonical site status
- Literature: key functional study findings

## Classification Logic
Applied rule: [e.g., "PVS1 + PM2_Supporting = Likely Pathogenic (LP rule 1)"]

## Limitations
- [Criteria not assessed and what data would be needed]

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常见模式

模式 1：已知致病移码变异 — “对 BRCA2 c.5946delT 进行分类” 阶段 0（验证）→ 阶段 1（gnomAD 中不存在，PM2_Supporting）→ 阶段 3（ClinVar 中为 Pathogenic，PP5）→ 阶段 4（DNA 修复结构域，PM1）→ 阶段 5（移码 + LOF 基因，PVS1）→ 阶段 6（文献 PS3） 结果：致病（PVS1 + PS3 + PM1 + PM2_Supporting + PP5）

模式 2：错义意义未明变异 — “BRCA1 p.Arg1699Gln 是否致病？” 阶段 0 → 阶段 1（罕见，PM2_Supporting）→ 阶段 2（REVEL 0.82，CADD 26，PP3）→ 阶段 3（ClinVar 中为 VUS）→ 阶段 4（BRCT 结构域，PM1）→ 阶段 6（活性降低，PS3_Moderate） 结果：可能致病（PS3_Moderate + PM1 + PM2_Supporting + PP3）

模式 3：常见良性变异 — “rs1800497 的 ACMG 分类” 阶段 1（gnomAD AF=0.21，BA1）→ 提前结束。结果：良性（BA1 单独成立）

模式 4：深部内含子变异 — “对 NM_000059.4:c.7977+100A>G 进行分类” 阶段 1（检查 AF）→ 阶段 5（SpliceAI < 0.1）→ 结果：可能良性或意义未明变异，具体取决于频率