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ToolUniverse CRISPR 筛选分析

规则零 — 首先检查预计算结果

在遵循以下任何指令之前，先扫描数据文件夹，查找：

• *_executed.ipynb → 使用 tu run read_executed_notebook '{"data_folder":"<path>","search":"<keyword>"}' 读取，并将其单元格输出作为权威答案引用
• 预计算结果文件（名称类似 *results*、*deseq*、*enrich*、*stats*、*_simplified.csv 的 CSV/TSV）→ 直接读取并报告所请求的值
• 标准分析脚本（analysis.R、run_*.py、find_*.R、*.Rmd）→ 按原样执行并读取输出

只有在上述内容均不存在时，才使用此技能下方的重新分析流程。从原始数据重新运行会得到与已发布答案不同的数值，而且耗时更长（通常需要 5–10 倍的轮次）。

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这是一项全面的技能，可通过稳健的统计分析和通路富集，分析 CRISPR-Cas9 遗传筛选，以识别必需基因、合成致死相互作用和治疗靶点。

概述

CRISPR 筛选通过系统性扰动基因并测量适应度效应，实现全基因组功能基因组学。本技能提供包含 8 个阶段的工作流，用于：

• 处理 sgRNA 计数矩阵
• 质量控制和标准化
• 基因层面的必需性评分（类似 MAGeCK 和 BAGEL 的方法）
• 检测合成致死
• 通路富集分析
• 结合 DepMap 优先排序药物靶点
• 整合表达和突变数据

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核心工作流

阶段 1：数据导入与 sgRNA 计数处理

加载 sgRNA 计数矩阵（MAGeCK 格式或通用 TSV）。预期列：sgRNA、Gene，以及样本列。创建实验设计表，将样本与条件（基线/处理）关联，并指定重复样本。

阶段 2：质量控制与过滤

评估 sgRNA 分布质量：

• 文库大小：每个样本的总 reads 数
• 零计数 sgRNA：统计各样本中的数量
• 低计数过滤：移除低于阈值的 sgRNA（默认：在超过 N-2 个样本中少于 30 reads）
• Gini 系数：评估每个样本分布的偏斜程度
• 报告过滤建议

阶段 3：标准化

对 sgRNA 计数进行标准化，以校正文库大小差异：

• 中位数比值（类似 DESeq2）：计算几何均值参考值，并将比值中位数作为 size factor
• 总计数（类似 CPM）：除以以百万为单位的文库大小

使用伪计数计算处理组与对照组之间的 log2 倍数变化（LFC）。

阶段 4：基因层面评分

两种评分方法：

• 类似 MAGeCK（RRA）：按 LFC 对所有 sgRNA 排名，计算每个基因的平均排名。平均排名越低，表示越必需。包括每个基因的 sgRNA 数量和平均 LFC。
• 类似 BAGEL（贝叶斯因子）：使用参考必需基因/非必需基因集来估计 LFC 分布。计算每个基因的似然比（贝叶斯因子）。BF 越高，表示基因越可能是必需基因。

阶段 5：合成致死检测

比较野生型和突变细胞系的必需性评分：

• 合并基因评分，计算 delta LFC 和 delta rank
• 筛选在突变细胞系中必需（LFC < 阈值）、但在野生型中不必需（LFC > -0.5），且排名变化较大的基因
• 按差异必需性排序

通过 PubMed 搜索查询 DepMap/文献中已知的依赖关系。

阶段 6：通路富集分析

将排名靠前的必需基因提交至 Enrichr，进行通路富集：

• KEGG 通路
• GO 生物过程
• 获取富集条目及其 p 值和基因列表

阶段 7：药物靶点优先级排序

综合评分由以下部分组成：

• 必需性（权重 50%）：CRISPR 筛选中的标准化平均 LFC
• 表达（权重 30%）：RNA-seq 的 log2 倍数变化（如有）
• 可成药性（权重 20%）：DGIdb 中的药物相互作用数量

查询 DGIdb 中的每个候选基因，以查找现有药物、相互作用类型和来源。

阶段 8：报告生成

生成 Markdown 报告，包含：

• 汇总统计（基因总数、必需基因、非必需基因）
• 排名前 20 的必需基因表格（排名、基因、平均 LFC、sgRNA、得分）
• 通路富集结果（每个数据库排名前 10 的条目）
• 候选药物靶点（排名、基因、必需性、表达 FC、成药性、优先级得分）
• 方法部分

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ToolUniverse 工具集成

使用的关键工具：

• PubMed_search_articles - 检索有关基因必需性和耐药性的文献
• ReactomeAnalysis_pathway_enrichment - 通路富集（参数：identifiers 以换行符分隔，page_size）
• enrichr_gene_enrichment_analysis - Enrichr 富集分析（参数：gene_list 数组，libs 数组）
• DGIdb_get_drug_gene_interactions - 药物-基因相互作用（参数：genes 为数组）
• DGIdb_get_gene_druggability - 成药性分类
• STRING_get_network - 蛋白质相互作用网络
• kegg_search_pathway - 按关键词搜索通路
• kegg_get_pathway_info - 按 ID 获取通路详情

癌症背景（对于耐药性筛选至关重要）：

• civic_search_evidence_items - 药物耐药性/敏感性的临床证据
• COSMIC_get_mutations_by_gene - 体细胞突变图谱
• cBioPortal_get_mutations - 特定癌症队列中的突变
• ChEMBL_search_targets - 结构性成药性评估

表达与变异整合：

• GEO_search_rnaseq_datasets / geo_search_datasets - 表达数据集
• ClinVar_search_variants - 已知致病变异
• gnomad_get_gene_constraints - 基因约束指标（pLI、oe_lof）
• UniProt_get_function_by_accession - 用于命中验证的蛋白质功能

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快速开始

import pandas as pd
from tooluniverse import ToolUniverse

# 1. Load data
counts, meta = load_sgrna_counts("sgrna_counts.txt")
design = create_design_matrix(['T0_1', 'T0_2', 'T14_1', 'T14_2'],
                               ['baseline', 'baseline', 'treatment', 'treatment'])

# 2. Process
filtered_counts, filtered_mapping = filter_low_count_sgrnas(counts, meta['sgrna_to_gene'])
norm_counts, _ = normalize_counts(filtered_counts)
lfc, _, _ = calculate_lfc(norm_counts, design)

# 3. Score genes
gene_scores = mageck_gene_scoring(lfc, filtered_mapping)

# 4. Enrich pathways
enrichment = enrich_essential_genes(gene_scores, top_n=100)

# 5. Find drug targets
drug_targets = prioritize_drug_targets(gene_scores)

# 6. Generate report
report = generate_crispr_report(gene_scores, enrichment, drug_targets)

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领域推理：命中结果是统计发现，而非生物学结论

筛选命中结果是统计发现，并非对生物学相关性的直接反映。被判定为必需基因，可能是因为它对细胞的普遍生长必不可少（管家基因），也可能是因为它对你筛选的特定表型至关重要（更值得关注）。务必将筛选命中结果与公开的必需性数据进行比较——使用 DepMap 泛癌依赖性评分，过滤掉在所有细胞系中普遍必需的基因。相比在每次筛选中都得分的基因，仅在你的特定背景下必需、但在 DepMap 中并非泛必需的基因，更值得作为后续研究候选对象。

先查证，别猜测：查询 DepMap 依赖性评分、已知核心必需基因集（Hart et al.、Blomen et al.）以及热门命中的 DGIdb 成药性数据。在查阅公开必需性数据库前，不要假定某个命中结果具有背景特异性。

解读框架

证据等级	标准	验证优先级
A -- 强命中	MAGeCK RRA p < 0.001，BAGEL BF > 5，>=3 个 sgRNA 的 LFC 一致	立即验证（单独 KO、生长实验）
B -- 中等命中	MAGeCK RRA p < 0.01，BAGEL BF 2-5，>=2 个 sgRNA 一致	次级验证组
C -- 弱／模糊	p > 0.01、BF < 2，或 sgRNA 效应不一致	降低优先级；检查拷贝数偏倚或种子效应

解读筛选结果：

• 某基因在各重复中的平均 LFC < -1.0，且有 >=3 个 sgRNA 效应一致，即为稳健的必需性命中；单个 sgRNA 的效应更可能来自脱靶，应予以标记。
• 必需基因阈值取决于具体背景：核心适应度基因（如核糖体、剪接体基因）应在任何筛选中耗竭，可用作阳性对照——若它们未出现在命中列表中，则说明存在 QC 问题。
• 合成致死命中（在突变体中耗竭、而在野生型中不耗竭）要求 delta-LFC > 1.5，并且在提名为治疗靶点之前，须在独立细胞系中确认。

报告中需回答的综合分析问题：

1. 顶级命中是否聚集在已知通路（Reactome/KEGG）中，还是分散各处——这可能表明存在技术噪声？
2. 已知必需基因（Hart 参考集）是否被正确识别，从而确认筛选质量？完整的 CEGv2 核心必需基因（约 684 个）和 NEGv1 非必需基因（约 928 个）参考集已打包在 scripts/ 中——使用 from reference_gene_sets import core_essential, nonessential, recovery_rate 加载。recovery_rate(top_depleted_genes) 可得出回收的核心必需基因比例（质量良好的全基因组筛选回收率应 >~0.8）。
3. 对于候选药物靶点：DGIdb 是否显示已有化合物？DepMap 是否确认其在多种细胞系中存在依赖性？

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参考文献

• Li W, 等（2014）MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens. Genome Biology
• Hart T, 等（2015）High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities. Cell
• Meyers RM, 等（2017）Computational correction of copy number effect improves specificity of CRISPR-Cas9 essentiality screens. Nature Genetics
• Tsherniak A, 等（2017）Defining a Cancer Dependency Map. Cell (DepMap)

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分析约定

重复样本的 Spearman 相关性——匹配论文的汇总层级

不同论文报告重复样本可重复性时采用的层级不同：sgRNA 级 CPM、基因级汇总 CPM，或基因级平均 CPM。预期 GT 几乎总是 sgRNA 级 Spearman（噪声更大，ρ 更低），而非基因级汇总结果。如果得到 ρ ≈ 0.6+，你很可能计算的是基因级结果；请改用每个 sgRNA 的 CPM 配对值。

Reactome GSEA 排序列

对 MAGeCK 输出运行 GSEA 时，应按论文指定的 neg|lfc 或等效效应量列排序（而不是 p 值）。检查 MAGeCK xlsx 中是否有 beta / sgRNA_effect / neg|score 列，并按降序排序。

通路命名

.gmt 包中的 Reactome 通路名称为原始名称（例如 "cGMP effects"、"Signaling by Hippo"）。需要匹配 Reactome 术语的答案必须原样使用确切标签——不要改写通路名称。

另请参阅

• ANALYSIS_DETAILS.md - 所有 8 个阶段的详细代码片段
• USE_CASES.md - 完整用例（必需性筛选、合成致死、药物靶点发现、表达整合）和最佳实践
• EXAMPLES.md - 用法示例和快速参考
• QUICK_START.md - 快速入门指南
• FALLBACK_PATCH.md - API 问题的回退模式