tooluniverse-epigenomics-chromatin

表观基因组学与染色质可及性研究

不适用（请改用其他技能）

• 甲基化芯片数据处理（CpG β 值、差异甲基化）→ 使用 tooluniverse-epigenomics
• RNA-seq 差异表达分析 → 使用 tooluniverse-rnaseq-deseq2
• GWAS 变异解读 → 使用 tooluniverse-gwas-snp-interpretation
• 从 VCF 进行变异功能注释 → 使用 tooluniverse-variant-analysis

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推理：先对问题分类

调用任何工具之前，先确定要回答的问题类型。不同类型对应不同的工具集。

(a) 某个位点上有哪些调控元件？ 使用 UCSC_get_encode_cCREs（基于区域）或 SCREEN_get_regulatory_elements（基于基因）。然后检查 ENCODE_get_chromatin_state 中的 ChromHMM 注释，以及 ENCODE_search_chromatin_accessibility 中的 ATAC-seq 证据。

(b) 哪些 TF 会在该处结合？ 使用 ReMap_get_transcription_factor_binding 查询 ChIP-seq 实验。使用 jaspar_search_matrices 获取结合基序，并检查序列是否破坏了已知基序。

(c) 变异如何影响调控？ 使用 RegulomeDB_query_variant 获取带评分的摘要。然后构建多层证据：UCSC_get_encode_cCREs（变异是否位于 cCRE 中？）、GTEx_get_single_tissue_eqtls（变异是否为 eQTL？）、jaspar_search_matrices（变异是否破坏 TF 基序？）。单一证据层不足以得出结论——请参阅下文的变异推理部分。

(d) 某个元件调控哪些基因？ 使用 GTEx_get_single_tissue_eqtls 或 GTEx_query_eqtl 查找表达与元件中变异相关的基因。使用 SCREEN_get_regulatory_elements，并设置 element_type="PLS"/"pELS"/"dELS"，对元件与启动子的关系进行分类。

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推理：组蛋白标记

在获取数据之前，先根据组蛋白标记的类型确定工具查询方式并解读结果。

• H3K4me3 = 活性启动子。如果存在该标记但没有 H3K27ac，启动子可能处于活跃状态，但并未高度乙酰化。
• H3K27ac = 活性增强子或启动子。信号强表示调控元件处于活跃状态。
• H3K4me1 = 预备状态或活性增强子。需要 H3K27ac 才能确认其活性；只有 H3K4me1 表示处于预备状态。
• H3K27me3 = Polycomb 抑制。基因被 PRC2 沉默。
• H3K9me3 = 组成型异染色质。区域在结构上处于沉默状态。
• H3K36me3 = 转录中的基因体。可确认转录延伸处于活跃状态。

双价启动子判定逻辑：如果在同一位点观察到 H3K4me3 与 H3K27me3 同时存在，则该启动子为双价启动子——处于预备状态，但并不活跃。这种情况常见于干细胞和受发育调控的基因。不要将这类基因报告为“正在活跃转录”。使用 GTEx_get_expression_summary 检查该基因是否在目标组织中实际表达。

推断规则：如果用户询问尚未查询的标记，先考虑：已发现的标记是否已经能回答问题？区域中的 H3K4me3 可预测活跃转录；除非需要专门确认转录延伸，否则可能无需再查询 H3K36me3。

推理：eQTL 解读

eQTL 表示变异 X 与组织 T 中基因 Y 的表达在统计学上相关。报告 eQTL 结果前，请按以下推理链进行分析：

1. 相关性 ≠ 因果关系。 该变异可能与因果变异存在 LD。请报告效应大小（NES）和 p 值，不要声称存在因果关系。
2. 检查组织特异性。 使用 GTEx_get_multi_tissue_eqtls 查看该效应是跨组织共享（多个组织中的 m 值接近 1.0），还是具有组织特异性（仅一个组织中的 m 值接近 1.0）。组织特异性 eQTL 是细胞类型特异性调控的更有力候选。
3. 与染色质信息交叉比对。 eQTL 变异是否位于 cCRE 内？使用 UCSC_get_encode_cCREs 查询该变异的坐标。如果是，该变异很可能通过调控元件发挥作用。
4. 检查 TF 基序是否受到破坏。 使用 jaspar_search_matrices 查找与 eQTL 位点重叠的基序。如果该变异的等位基因具有不同的基序得分，则它是候选因果变异。
5. 效应方向很重要。 NES 为正 = 参考等位基因提高表达。NES 为负 = 替代等位基因降低表达。

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推理：变异的调控影响

评估非编码变异的调控影响时，应从多个相互独立的证据层面构建证据。任何单一层面都不足以得出结论。

层面 1 — RegulomeDB 得分：概率高（得分 1a–2b）表示 eQTL、TF 结合和 DNase 的证据趋于一致。得分 4–7 表示支持较弱。可将其用作初筛条件。

层面 2 — 调控元件重叠：在该变异的坐标处查询 UCSC_get_encode_cCREs。如果变异落在 cCRE 内（尤其是 PLS 或 pELS），则它处于具有功能的环境中。

层面 3 — eQTL 证据：查询 GTEx_get_single_tissue_eqtls，查找附近的基因。如果该变异是显著 eQTL，则这一关联支持其具有调控功能。

层面 4 — TFBS 破坏：查询 jaspar_search_matrices，查找在该位点具有基序的 TF。如果该变异改变了基序中信息含量高的位置，则它是强有力的功能候选变异。

综合规则：分别报告每个层面。3 个或更多层面的证据趋于一致 = 高可信度调控变异。仅有单一层面的证据（例如，仅有 eQTL）时应谨慎判断。

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阶段 0：消歧

MyGene_query_genes：query（字符串）。将基因符号转换为 Ensembl ID 和坐标。按 symbol == '<GENE>' 筛选结果——第一个结果可能不匹配。

ensembl_lookup_gene：gene_id（Ensembl ID）、species（必填，"homo_sapiens"）。返回 chr/start/end。

关键格式说明：

• GTEx 要求带版本号的 GENCODE ID：ENSG00000012048.20
• RegulomeDB 使用 rsID：rs4994
• GTEx 变异 ID：chr17_43705621_T_C_b38
• UCSC cCRE 区域：chrom="chr17", start=7668421, end=7687490

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阶段 1：组蛋白修饰与 ChIP-seq

ENCODE_search_histone_experiments：target（组蛋白标记）、cell_type（或别名 tissue）、biosample_term_name（最明确的 ENCODE 本体名称）、limit。

ENCODE 解剖学术语说明："breast" → 尝试 "breast epithelium" 或 "mammary epithelial cell"；"brain" → "brain" 可用；如果结果为 0，请追加 "tissue"、"epithelium" 或 "cell"。

result = tu.tools.ENCODE_search_histone_experiments(target="H3K27ac", cell_type="GM12878", limit=5)
# result["data"]["experiments"][0]["accession"] -> "ENCSR000AKC"

GEO_search_chipseq_datasets：用于查找较早或非 ENCODE 的 ChIP-seq 数据集的备用工具。

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第 2 阶段：染色质可及性与结构

ENCODE_search_chromatin_accessibility：cell_type、limit。返回 ATAC-seq 实验。

ENCODE_get_chromatin_state：cell_type、limit。返回 ChromHMM 15 状态注释（TssA、Enh、TssBiv、ReprPC 等）。用于确认双价启动子状态或增强子分类。

ENCODE_search_rnaseq_experiments：assay_type（默认值为 "total RNA-seq"）、biosample、limit。如果结果为 0，请使用 assay_type="polyA plus RNA-seq" 重试。

GEO_search_rnaseq_datasets / GEO_search_atacseq_datasets：query、organism、limit（也可以使用 max_results）。ATAC 工具会自动添加“ATAC-seq”。

ReMap_get_transcription_factor_binding（CTCF）：gene_name="CTCF"、cell_type、limit。返回 ENCODE TF ChIP-seq 实验。

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第 3 阶段：调控元件识别

SCREEN_get_regulatory_elements：gene_name、element_type（PLS/pELS/dELS/CTCF-only/DNase-H3K4me3）、limit。

UCSC_get_encode_cCREs：chrom（必填）、start（必填）、end（必填）、genome（默认值为 "hg38"）。返回 cCRE 及其 DNase、H3K4me3、H3K27ac、CTCF 信号的 Z 分数。

# cCREs near TP53
result = tu.tools.UCSC_get_encode_cCREs(chrom="chr17", start=7668421, end=7687490, genome="hg38")

ENCODE_search_annotations：annotation_type（"candidate Cis-Regulatory Elements" 或 "chromatin state"）、biosample_term_name、organism、assembly、limit。

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第 4 阶段：eQTL 分析

GTEx_get_single_tissue_eqtls：gencode_id（Ensembl 基因 ID 列表，可带版本号或不带）、tissue_site_detail_id、page。该工具不接受基因符号；如果只有基因符号，请使用下方的 GTEx_query_eqtl。返回各组织中的显著 eQTL，包含 snpId、pValue、tissueSiteDetailId、nes（标准化效应值）。

result = tu.tools.GTEx_get_single_tissue_eqtls(gencode_id=["ENSG00000012048"])  # BRCA1
from collections import Counter
tissue_counts = Counter(e["tissueSiteDetailId"] for e in result["data"])

GTEx_query_eqtl：gene_symbol、tissue（tissueSiteDetailId）、page（从 1 开始计数）、size。用于查询特定组织。

GTEx_get_multi_tissue_eqtls：operation="get_multi_tissue_eqtls"、gencode_id（必填，带版本号）。返回每个变异的 m 值，显示其在组织间的共享情况。m 值接近 1.0 表示存在效应；接近 0.0 表示不存在效应。

result = tu.tools.GTEx_get_multi_tissue_eqtls(
    operation="get_multi_tissue_eqtls",
    gencode_id="ENSG00000012048.20"
)

GTEx_calculate_eqtl：operation="calculate_eqtl"、gencode_id、variant_id（chr_pos_ref_alt_b38）、tissue_site_detail_id。适用于不显著的配对。

eQTL_list_datasets / eQTL_get_associations：已弃用，请勿使用。EBI eQTL Catalogue 已停用其 REST API（HTTP 410 Gone），因此这两个工具都会返回错误。组织 eQTL 请使用上方的 GTEx eQTL 工具；GWAS/QTL 共定位请使用 OpenTargets_get_credible_set_colocalisation。完整的 eQTL Catalogue 仅以 tabix/FTP 汇总统计数据的形式提供。

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第 5 阶段：基因表达背景

GTEx_get_expression_summary：gene_symbol。推荐使用——会自动解析 GENCODE 版本。返回各组织的 TPM 中位数。

result = tu.tools.GTEx_get_expression_summary(gene_symbol="BRCA1")
# data: {geneExpression: [{tissueSiteDetailId, median (string TPM), unit, ...}]}
top_tissues = sorted(result["data"]["geneExpression"], key=lambda x: float(x["median"]), reverse=True)[:5]

GTEx_get_median_gene_expression：需要 operation="get_median_gene_expression" 和准确的带版本号 gencode_id。仅在需要精确版本号时使用。

GTEx_get_tissue_sites：无参数。返回所有 tissueSiteDetailId 值。

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第 6 阶段：转录因子结合

jaspar_search_matrices：name（TF 名称）、collection（"CORE"）、tax_group（"vertebrates"）、species（"9606"）、page_size。

result = tu.tools.jaspar_search_matrices(name="CTCF", collection="CORE", page_size=5)

jaspar_get_matrix：返回 JASPAR 矩阵 ID 对应的位置频率矩阵。用于检查变异等位基因是否会破坏高信息含量位置。

ReMap_get_transcription_factor_binding：gene_name（TF）、cell_type、limit。与第 2 阶段用于 CTCF 的工具相同，适用于任何 TF。

STRING_get_functional_annotations：identifiers（基因名称）、species（9606）、category（"Process"/"Function"/"KEGG"）。返回用于调控背景的 GO/KEGG/Reactome 注释。

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阶段 7：变异调控评分

RegulomeDB_query_variant：rsid（例如，“rs4994”）。返回概率、排名（1a = 最强，7 = 最弱）和组织特异性评分。

result = tu.tools.RegulomeDB_query_variant(rsid="rs4994")
score = result["data"]["regulome_score"]
# score["ranking"]: "1a" (eQTL + TF + motif + DNase) ... "7" (no evidence)
# score["probability"]: 0.0–1.0
top_tissues = sorted(score["tissue_specific_scores"].items(), key=lambda x: float(x[1]), reverse=True)[:5]

1a–1f 级均有 eQTL 证据。2a–3b 级有 TF 结合证据，但没有 eQTL。4–7 级的证据依次减弱。使用排名 <= 2b 作为“强调控支持”的阈值。

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阶段 8：整合

报告前先合并各层级的证据：

• T1（直接实验）：ENCODE ChIP-seq 实验、GTEx eQTL p < 5e-8
• T2（强计算证据）：RegulomeDB 评分 <= 2、SCREEN cCRE 分类、ChromHMM 状态
• T3（中等证据）：eQTL p < 0.05、JASPAR 基序匹配、多组织 m-value > 0.5
• T4（基于注释）：STRING GO 术语、文献参考

来自独立来源的 T1+T2 证据相互印证（例如，ENCODE ChIP-seq 与一个 RegulomeDB 1a 变异重叠，且该变异有 GTEx eQTL），构成调控功能的强有力证据。应明确指出不同层级之间的矛盾（例如，RegulomeDB 评分高，但没有 eQTL）。

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备用策略

阶段	主要工具	备用工具
组蛋白 ChIP-seq	ENCODE_search_histone_experiments	GEO_search_chipseq_datasets
RNA-seq	ENCODE_search_rnaseq_experiments（总 RNA-seq）	使用 polyA plus RNA-seq 重试
ATAC-seq	ENCODE_search_chromatin_accessibility	GEO_search_atacseq_datasets
cCRE	UCSC_get_encode_cCREs	SCREEN_get_regulatory_elements
eQTL	GTEx_get_single_tissue_eqtls	GTEx_query_eqtl
表达	GTEx_get_expression_summary	GTEx_get_median_gene_expression
TF 基序	jaspar_search_matrices	ReMap_get_transcription_factor_binding
变异评分	RegulomeDB_query_variant	手动合并 eQTL + TF 结合证据