tooluniverse-noncoding-rna

非编码 RNA 分析

用于识别、注释和解读非编码 RNA 及其生物学作用的流程。涵盖 microRNA（miRNA）、长链非编码 RNA（lncRNA）和其他 ncRNA 类别。

关键原则：

1. 类别决定功能——miRNA 抑制 mRNA 翻译；lncRNA 的作用机制多种多样（支架、引导、诱饵、增强子）；rRNA/tRNA 具有结构功能
2. 靶标比 ncRNA 本身更重要——对于 miRNA，受调控的 mRNA 靶标决定表型
3. 表达背景至关重要——ncRNA 具有很强的组织/细胞类型特异性
4. 保守性表明功能——高度保守的 ncRNA（miR-let-7、MALAT1）具有明确的作用
5. 证据分级——T1：已验证的靶标（报告基因实验、CLIP-seq）；T2：高置信度计算预测；T3：表达相关性；T4：仅基于序列的预测

基于类型进行推理——查证，不要猜测： 非编码 RNA 的功能取决于其类型：miRNA 会沉默靶 mRNA（在 miRTarBase/TargetScan 中查询靶标）；lncRNA 的功能多种多样（支架、引导、诱饵——针对特定 lncRNA 查阅文献）；circRNA 可能会吸附 miRNA。

对于任何 ncRNA 查询：首先根据名称/序列确定类别，然后选择合适的证据来源。不要仅凭名称推断功能——名为“LINC”的基因可能有明确的作用机制，也可能没有。在解读之前，务必在 PubMed 中搜索特定的 ncRNA。对于 miRNA，miRTarBase 中经过验证的靶标（T1）比任何计算预测都更可靠——没有实验支持的预测靶标只是一个假设，并非研究发现。对于 lncRNA，作用机制几乎总是由实验研究确定；使用 PubMed_search_articles 并搭配 lncRNA 名称及“mechanism”或“function”进行搜索，以查找相关证据。对于 circRNA，miRNA 吸附是最常被提出的作用机制，但这种说法常常被过度夸大——在断言这一机制前，应查找 CLIP-seq 或报告基因实验的证据。

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适用场景

• “miR-21 的靶标有哪些？”
• “查找与乳腺癌相关的 lncRNA”
• “这个 lncRNA 在不同物种间是否保守？”
• “哪些 miRNA 调控 TP53？”
• “注释这些非编码 RNA ID”
• “哪些 miRNA 是 [疾病] 的生物标志物？”

不适用于此技能：对于 mRNA 表达分析，请使用 tooluniverse-rnaseq-deseq2。对于 CRISPR 筛选，请使用 tooluniverse-crispr-screen-analysis。

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核心工具

工具	用途
miRBase_search_mirna	按名称、登录号或序列搜索 miRNA
miRBase_get_mirna	miRNA 详细信息（序列、基因组位置、家族）
miRBase_get_mirna	成熟 miRNA 序列和注释
PubMed_search_articles	在文献中搜索经验证的 miRNA 靶标（例如，“miR-21 靶标验证”）
LNCipedia_search_lncrna	按名称、基因符号或转录本 ID 搜索 lncRNA
LNCipedia_get_lncrna	lncRNA 转录本详细信息（序列、结构、保守性）
LNCipedia_get_lncrna_xrefs	包含所有转录本变体的 lncRNA 基因信息
LNCipedia_search_ncrna_by_type	列出 lncRNA 基因的所有转录本
LNCipedia_get_lncrna_publications	lncRNA 序列（FASTA 格式）
RNAcentral_search	跨数据库搜索所有类型的 ncRNA
RNAcentral_get_by_accession	来自 40 多个数据库的 ncRNA 详细注释
RNAcentral_get_genome_locations	给定生物体中 URS 登录号的基因组坐标（染色体/链/起点/终点、组装版本）——与 get_by_accession 询问的内容不同（后者提供注释，而非坐标）
RNAcentral_get_sequence	URS 登录号对应的原始 FASTA 核苷酸序列
MODOMICS_search_modifications / MODOMICS_list_modifications	按名称/分子式查找 RNA 化学修饰（m6A、假尿苷、m5C 等），或浏览全部 430 多种修饰
Rfam_get_family	RNA 家族详情（结构、比对、物种分布）
Rfam_search_sequence	按关键词搜索 RNA 家族
DisGeNET_search_gene	ncRNA 与疾病的关联
PubMed_search_articles	ncRNA 文献
GTEx_get_median_gene_expression	ncRNA 基因的组织表达情况

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工作流

Phase 0: ncRNA Identity & Classification
  Name/ID → miRBase/LNCipedia/RNAcentral → class, sequence, genomic location
    |
Phase 1: Target & Interaction Analysis
  miRNA → target mRNAs; lncRNA → interacting proteins/RNAs/chromatin
    |
Phase 2: Expression & Tissue Specificity
  GTEx/GEO → where is it expressed? Tissue-specific or ubiquitous?
    |
Phase 3: Disease Associations
  DisGeNET/PubMed/CTD → ncRNA-disease links with evidence
    |
Phase 4: Functional Interpretation
  Pathway enrichment of targets → biological role → clinical significance

阶段 0：ncRNA 身份与分类

按大小和数据库划分的 ncRNA 类别：

• miRNA（约 22 nt，miRBase）：通过结合 3'UTR 实现转录后沉默
• lncRNA（>200 nt，LNCipedia）：功能多样——染色质重塑、转录调控、miRNA 海绵
• rRNA（120-5000 nt，RNAcentral/Rfam）：核糖体组分
• tRNA（约 76 nt，RNAcentral）：氨基酸递送
• snoRNA（60-300 nt，Rfam）：rRNA 修饰（甲基化、假尿苷化）
• snRNA（约 150 nt，Rfam）：剪接体组分
• piRNA（26-31 nt，RNAcentral）：生殖系中的转座子沉默
• circRNA（长度不定，RNAcentral）：miRNA 海绵、蛋白质支架（需要实验依据）

识别工作流：

• 名称以 miR- 或 hsa-mir- 开头 → 搜索 miRBase
• 名称以 LINC、MALAT、HOTAIR、XIST 开头，或以 -AS1 结尾 → 搜索 LNCipedia
• 任意类型的 ncRNA → 搜索 RNAcentral（聚合所有数据库）
• RNA 家族相关问题 → 搜索 Rfam

基因组位置和原始序列（获得来自 RNAcentral_search 的 URS 登录号后）：RNAcentral_get_by_accession 提供跨数据库的注释；RNAcentral_get_genome_locations/RNAcentral_get_sequence 则是分别用于获取基因组坐标和原始 FASTA 序列的独立工具——已通过实时验证：

tu.run_tool("RNAcentral_get_genome_locations", {"urs_id": "URS00003B7674", "taxid": 9606})
#   -> locations[] with chromosome, strand, start, end, assembly_id (GRCh38), gca_accession
tu.run_tool("RNAcentral_get_sequence", {"urs_id": "URS00003B7674"})
#   -> real verified response for let-7a-5p:
#      {"fasta_header": "URS00003B7674 ncRNA from 61 species",
#       "sequence": "UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU", "length": 22}

RNA 化学修饰（MODOMICS）——用于表观转录组相关问题（m6A、假尿苷、m5C 等），对于 snoRNA 引导的 rRNA 修饰和基于质谱的修饰鉴定尤其相关：

tu.run_tool("MODOMICS_search_modifications", {"query": "pseudouridine"})
#   -> matches by name/short-name/formula, e.g. id 8 "1-methyl-3-(3-amino-
#      3-carboxypropyl)pseudouridine"
tu.run_tool("MODOMICS_list_modifications", {"limit": 20})
#   -> browse all 430+ known modifications with formula/mass/reference_moiety

MODOMICS_get_modification 已损坏——已通过实时验证，请勿用于查询特定 ID。 使用 modification_id 58、78 或 22 调用此工具时（根据工具自身说明，它们分别对应不同的知名修饰：m6A、假尿苷、m5C），每次都会返回完全相同的硬编码记录（id 2，“5,2'-O-二甲基胞苷”）——该参数会被静默忽略。search/list 会根据查询正确返回不同结果，并提供 name/short_name/formula/mass_avg，足以满足大多数需求；目前无法查询特定 ID 对应的 SMILES/单同位素质量/产物离子详情（这些信息只有 get_modification 能提供）——应如实说明，不要捏造这些字段。

阶段 1：靶标与相互作用分析

对于 miRNA——靶标决定其生物学作用：

主要工具：ENCORI_get_miRNA_targets 可查询 ENCORI/starBase 中的 miRNA-靶标相互作用（有 CLIP-seq 支持及计算预测），无需下载：

1. miRNA → 靶标：ENCORI_get_miRNA_targets(mirna="hsa-miR-21-5p", clip_min=1)——每条结果都会报告 clip_experiments（CLIP-seq 支持度；数值越高，实验依据越充分）和 predicted_by（预测该结果的程序）。结果按 CLIP 支持度排序，因此前几行是证据支持最充分的靶标。
2. 基因 → miRNA：ENCORI_get_miRNA_targets(gene="TP53")——查询靶向某个基因的 miRNA。

辅助／备用方法： 3. 文献（了解机制／验证背景）：PubMed_search_articles(query="miR-21 target validation luciferase") 4. 交叉引用：miRBase_get_mirna_xrefs(accession="MIMAT0000076") 5. 对于 ENCORI 中没有的新型 miRNA：在 PubMed 中搜索“[miRNA] target”。

研究较充分的 miRNA 靶标（常见癌基因型 miRNA／肿瘤抑制因子）：

• miR-21：PTEN、PDCD4、TPM1、RECK、SPRY1、SPRY2、BTG2
• miR-155：SOCS1、SHIP1、AID、TP53INP1
• miR-122：SLC7A1、ADAM17（也是 HCV IRES 辅因子）
• let-7：RAS、HMGA2、MYC、LIN28

靶标解读框架：

• 已验证（T1）：荧光素酶报告实验、CLIP-seq、degradome-seq——结论应以这些证据为依据
• 高可信度预测（T2）：TargetScan 保守位点、DIANA-microT 得分 > 0.9——用于支持已验证的发现
• 仅预测（T3-T4）：miRanda、PicTar、RNA22——仅用于生成假设；不要作为研究发现报告

对于 lncRNA——作用机制各不相同：

lncRNA 机制	示例	研究方法
染色质修饰因子	HOTAIR、XIST	通过 PubMed 查询相互作用蛋白（PRC2、LSD1）
转录调节因子	NEAT1、MEG3	根据基因组位置检查邻近基因（顺式调控）
miRNA 海绵	MALAT1、circRNAs	搜索 miRNA 结合位点
支架	NKILA、BCAR4	检查蛋白质相互作用
增强子 RNA	eRNAs	检查 ENCODE 增强子注释

阶段 2：表达与组织特异性

GTEx_get_median_gene_expression(gene_symbol="MIR21")  # miRNA host gene expression
# Note: GTEx measures RNA-seq; miRNA expression may need miRNA-seq data from GEO

解读：组织特异性 ncRNA 往往在相应组织中具有重要功能。广泛表达的 ncRNA（如 MALAT1）通常具有管家基因功能。

阶段 3：疾病关联

DisGeNET_search_gene(query="MIR21")  # miR-21 disease associations
PubMed_search_articles(query="miR-21 biomarker cancer")

重要的 ncRNA-疾病关联（公认的 T1 示例——务必通过 DisGeNET 或 PubMed 核实特定 ncRNA）：

• miR-21：多种癌症中的癌基因型 miRNA；靶向 PTEN、PDCD4、TPM1（数百项 T1 研究）
• miR-155：B 细胞淋巴瘤、炎症——免疫调节
• miR-122：丙型肝炎肝病——HCV 复制辅因子；治疗靶标（miravirsen）
• let-7 家族：肺癌、干细胞分化——作为肿瘤抑制因子靶向 RAS、HMGA2
• HOTAIR：乳腺癌／结直肠癌——募集 PRC2，促进转移
• MALAT1：肺癌／转移——剪接调控
• XIST：X 染色体失活、癌症——染色质沉默
• H19：Beckwith-Wiedemann 综合征、癌症——印记型 lncRNA，miR-675 宿主
• ANRIL：CVD、糖尿病、癌症——CDKN2A/B 位点调控（经 GWAS 验证）

第 4 阶段：功能解读

识别 miRNA 靶标（第 1 阶段）后，进行通路富集分析：

# Collect validated target gene symbols
targets = ["PTEN", "PDCD4", "TPM1", "RECK", "SPRY1"]  # miR-21 targets

# Pathway enrichment
ReactomeAnalysis_pathway_enrichment(identifiers="PTEN PDCD4 TPM1 RECK SPRY1")
STRING_get_network(identifiers="PTEN\rPDCD4\rTPM1\rRECK\rSPRY1", species=9606)

解读：如果 miR-21 靶标富集于细胞凋亡和 PI3K-AKT 信号通路，则 miR-21 是一种致癌 miRNA，可通过同时抑制多种肿瘤抑制因子来促进细胞存活。

报告结构：

1. ncRNA 身份 — 类别、序列、基因组位置、保守性
2. 靶标/相互作用 — 有证据等级支持的已验证靶标
3. 表达谱 — 组织特异性、疾病特异性表达变化
4. 疾病关联 — 有证据等级支持的疾病关联
5. 通路分析 — 靶标中富集的通路
6. 机制模型 — 该 ncRNA 如何影响疾病生物学
7. 临床潜力 — 生物标志物用途、治疗靶标潜力（antagomir、ASO）

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局限性

计算流程：TargetScan 预测靶标（下载并处理）

TargetScan 提供最佳的计算 miRNA 靶标预测，但没有 REST API。请下载数据并在本地处理：

# Step 1: Download TargetScan predicted targets (one-time, ~10MB zipped)
# URL: https://www.targetscan.org/vert_80/vert_80_data_download/Summary_Counts.default_predictions.txt.zip
import pandas as pd
import zipfile, io, requests

url = "https://www.targetscan.org/vert_80/vert_80_data_download/Summary_Counts.default_predictions.txt.zip"
resp = requests.get(url, timeout=60)
with zipfile.ZipFile(io.BytesIO(resp.content)) as z:
    fname = z.namelist()[0]
    df = pd.read_csv(z.open(fname), sep='\t')

# Step 2: Query for a specific miRNA family
mirna = "miR-21-5p"  # or "miR-21/590-5p" (TargetScan uses family names)
targets = df[df['miRNA Family'].str.contains("miR-21", case=False, na=False)]

# Step 3: Rank by cumulative weighted context++ score
targets_ranked = targets.sort_values('Cumulative weighted context++ score', ascending=True)
print(f"Top 20 predicted targets of {mirna}:")
for _, row in targets_ranked.head(20).iterrows():
    print(f"  {row['Target Gene']:10s} score={row['Cumulative weighted context++ score']:.3f}  "
          f"sites={row['Total num conserved sites']}")

解读：context++ 分数越低，预测的抑制作用越强。保守位点（>1）具有更高的可信度。

计算流程：miRTarBase 已验证靶标（下载并处理）

miRTarBase 受到 Cloudflare 保护，无法通过程序访问。请使用 R/Bioconductor 数据包或批量下载：

# Option 1: Download from miRTarBase bulk export (requires browser download first)
# Go to: https://mirtarbase.cuhk.edu.cn/~miRTarBase/miRTarBase_2025/
# Download: hsa_MTI.xlsx (human miRNA-target interactions)

# Option 2: Use the GitHub data dump
# https://github.com/jorainer/mirtarbase — R package with cached data

# Once you have the file:
import pandas as pd
mti = pd.read_excel("hsa_MTI.xlsx")  # or read_csv if TSV

# Filter for your miRNA
mir21_targets = mti[mti['miRNA'].str.contains('hsa-miR-21', case=False, na=False)]
print(f"miR-21 validated targets: {len(mir21_targets)}")

# Filter by evidence strength
strong = mir21_targets[mir21_targets['Support Type'].str.contains(
    'Luciferase|Reporter|Western|CLIP', case=False, na=False
)]
print(f"  Strong evidence (reporter/CLIP): {len(strong)}")
for _, row in strong.head(10).iterrows():
    print(f"    {row['Target Gene']:10s} — {row['Support Type']}")

无法下载时：对于研究较充分的 miRNA，请使用第 1 阶段内置的参考表，或在 PubMed 中搜索已验证的靶标。

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局限性

• miRNA 靶标预测噪声较大 — 即使是最佳算法，假阳性率也超过 50%；应始终优先考虑经实验验证的靶标
• lncRNA 功能表征不足 — 仅约 5% 的已注释 lncRNA 功能已知
• 表达测量结果各异 — miRNA-seq、RNA-seq 和微阵列检测到的 ncRNA 类别不同；请确认检测类型
• 物种差异 — miRNA 通常具有保守性，但 lncRNA 往往具有物种特异性；跨物种 lncRNA 比较并不可靠