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蛋白质相互作用网络分析

使用 ToolUniverse 工具进行全面的蛋白质相互作用网络分析。通过 4 阶段工作流分析蛋白质网络：标识符映射、网络检索、富集分析和可选的结构数据。

领域推理：明确相互作用类型

当有人询问蛋白质相互作用时，先询问：是物理相互作用（它们是否结合？），还是功能相互作用（它们是否影响同一条通路？）。STRING 同时包含这两类信息——较高的 combined_score 并不意味着存在物理结合。要获取物理结合证据，请专门检查实验评分（escore）。如果 tscore（文本挖掘）或 dscore（数据库）的评分较高，但 escore 较低，这更可能表示共同注释或共同引用，而非直接结合。

查询，不要猜测：蛋白质相互作用评分、实验性证据类型，以及两个特定蛋白质是否有已知的共晶结构。使用 STRING escore 和 BioGRID 实验数据——不要仅凭通路中的共同成员身份推断存在结合。

使用的数据库

数据库	覆盖范围	API 密钥	用途
STRING	1,400 多万种蛋白质，5,000 多种生物	不需要	主要相互作用数据源
BioGRID	230 多万种相互作用，80 多种生物	需要	备用数据源、整理过的数据
SASBDB	2,000 多条 SAXS/SANS 记录	不需要	溶液结构
Complex Portal	整理过的复合物（包括 CORUM 数据）	不需要	整理过的复合物成员关系／化学计量比

4 阶段工作流

1. 标识符映射 — STRING_map_identifiers()：验证蛋白质名称，获取 STRING ID
2. 网络检索 — STRING_get_network()（主要）；BioGRID_get_interactions()（备用，需要 API 密钥）
3. 富集分析 — 使用 STRING_functional_enrichment() 进行 GO/KEGG/Reactome 分析；使用 STRING_ppi_enrichment() 测试功能一致性
4. 结构数据（可选） — 使用 SASBDB_search_entries() 搜索 SAXS/SANS 溶液结构

可参阅 python_implementation.py 查看可运行示例（example_tp53_analysis()、analyze_protein_network()）。

Complex Portal：整理过的复合物成员关系

STRING/BioGRID 回答的是“A 和 B 是否相互作用”；Complex Portal 回答的是另一个问题——“已知生物复合物的完整、经整理的成员组成和化学计量比是什么。”当问题涉及特定的命名复合物或隐含的多亚基组装体（例如“ SAGA 复合物包含什么”，“什么复合物通过调控 p53 发挥作用”），而不是成对或网络层级的相互作用时，请使用它。

Phase 1: ComplexPortal_search_complexes(query=..., species=..., number=...) -> ranked candidate complexes,
         each with complex_id, name, description, and a subunits[] list (identifier, name,
         interactor_type: "protein" or "small molecule" for bound cofactors like zinc)
Phase 2: ComplexPortal_get_complex(complex_id) -> full detail for one specific complex by its CPX- ID

真实示例（已在线验证）：ComplexPortal_search_complexes(query="TP53", species="Homo sapiens") -> 返回真实复合物，包括 CPX-6093“TP53-MDM2-MDM4 转录调控复合物”，其亚基为 P04637/Q00987/O15151；还包括两种 SAGA 复合物变体（KAT2A/KAT2B），它们通过 TP53/MYC 招募。这些都是真实的多亚基组装体，具有通过 UniProt 标识的真实亚基，其中还包括小分子辅因子（例如锌原子 CHEBI:27363）以及蛋白质亚基。

注意事项（已在线验证）：即使查询成功，ComplexPortal_get_complex 在其自身返回的字段中也可能给出 complex_id: null, name: null——请使用 systematic_name 和 subunits 列表确认获取的是正确复合物，并保留从 ComplexPortal_search_complexes 获取的 complex_id，不要依赖 get_complex 回传的字段。

参数

参数	默认值	描述
proteins	必填	基因符号或 UniProt ID
species	9606	NCBI 分类学 ID
confidence_score	0.7	最低相互作用置信度（0–1）
include_biogrid	False	使用 BioGRID 作为备用数据源（需要 API 密钥）
include_structure	False	使用 SASBDB 结构数据（速度较慢）

置信度评分指南

评分	用途
0.4	探索性分析（STRING 默认阈值）
0.7	推荐——可靠的相互作用
0.9	仅核心相互作用

网络边字段（STRING）

每条交互边返回的关键字段：

• score — 综合置信度（0–1）
• escore — 实验评分（用于物理结合证据）
• dscore — 数据库评分
• tscore — 文本挖掘评分
• ascore — 共表达评分
• preferredName_A、preferredName_B — 基因名称

扩展分析工具

信号通路：

• OmniPath_get_signaling_interactions — 有向、有符号的 PPI（刺激/抑制）
• Reactome_map_uniprot_to_pathways — 将蛋白质映射到 Reactome 通路（参数：uniprot_id）
• ReactomeAnalysis_pathway_enrichment — 基因集的通路富集分析
• SIGNOR（基于文献的因果信号）— 见下文

SIGNOR：因果信号交互

上文的 STRING/BioGRID 会告诉你蛋白质 A 和蛋白质 B 存在交互（物理或 功能上的），但不会说明其方向或效应。SIGNOR 可弥补这一不足：它是一个 经过人工整理的数据库，其中每条边都是一个有向因果陈述——“A 通过机制 M （磷酸化、泛素化、转录调控、结合等）上调/下调 B 的活性/数量，可选地标注 残基 R”——且每条陈述都有特定的 PMID 支持。它与 OmniPath_get_signaling_interactions 属于同类有向、有符号边，但数据来自 单一的整理来源，并提供每条边的机制、残基和文献细节，而非聚合多个数据库的 结果；若需要为因果主张提供相互印证的证据，可同时使用二者。

工具（均为真实工具，已在线验证——entity_id/蛋白质标识符应使用 UniProt 登录号，例如 EGFR 对应 P00533，而非基因符号）：

工具	用途	关键参数
SIGNOR_get_interactions	一个蛋白质的上游调节因子和下游靶标	entity_id（UniProt 登录号）、organism（taxid，默认值为 9606）、limit
SIGNOR_list_pathways	浏览经过整理的信号通路（以疾病或过程命名）	query（可选关键词，例如 "apoptosis"、"MAPK"）
SIGNOR_get_pathway	一个经过整理的通路中的所有因果交互	pathway_id（来自 list_pathways，例如 "SIGNOR-EGF"）、limit
SIGNOR_connect_proteins	连接两个或更多蛋白质的最短整理因果子网络	proteins（UniProt 登录号数组，至少 2 个）、level（1=仅直接连接，2=一个中间节点，3=两个中间节点）、limit

每条交互都会返回 source_entity/target_entity（以及对应的 UniProt source_id/target_id）、effect（例如 "down-regulates activity"、 "up-regulates quantity by expression"）、mechanism（例如 "phosphorylation"、"ubiquitination"、"binding"、"transcriptional regulation"——未指定时可以为空字符串）、residue（可为空）、 pmid、direct（布尔值——true 表示没有已知中间节点；SIGNOR 自身的 connect_proteins 输出可能在一条路径中混合 direct: true 和 direct: false 的边，因此应逐条检查此字段，而不要假设整条路径都是直接连接），以及一个 与置信度相关的 score。

工作流——追踪两个蛋白质之间的因果路径：

SIGNOR_connect_proteins(proteins=["P00533", "P28482"], level=2)  # EGFR -> ERK2(MAPK1)

返回连接它们的整理后子网络（在线验证结果显示，真实边包括 EGFR 自身的上游 调节因子 ERRFI1 和 PRKG2，以及在 2 跳邻域中共同出现的转录连接，例如 JAK2->MYC 和 LCK->STAT3——connect_proteins 返回所请求蛋白质周围的局部因果 图，而非仅返回一条最短路径；若需要一条特定路线，请筛选实际从源节点连接到 目标节点的边）。

工作流——浏览疾病/过程通路，然后检查某个蛋白质在其中的作用：

SIGNOR_list_pathways(query="cancer")          # -> pathway_id, e.g. "SIGNOR-EGF" (EGFR Signaling)
SIGNOR_get_pathway(pathway_id="SIGNOR-EGF")   # -> all curated edges in that pathway (metadata.total_interactions gives the true count if limit truncates)
SIGNOR_get_interactions(entity_id="P00533")   # -> zoom into EGFR specifically: e.g. real edges show VCB-Cul2 ubiquitinating/destabilizing EGFR (PMID:15590694) and EGFR phosphorylating IKBKE (PMID:27287717)

可成药性与临床背景：

• DGIdb_get_drug_gene_interactions — 枢纽蛋白的药物交互（参数：genes，数组）
• DGIdb_get_gene_druggability — 可成药性类别
• gnomad_get_gene_constraints — 基因必需性指标（pLI、oe_lof）
• civic_search_evidence_items — 网络蛋白质突变的临床证据
• UniProt_get_function_by_accession — 蛋白质功能注释

工具专属说明

IntAct 相互作用数据

interaction_ids 位于响应的 metadata 字段中，而不在顶层：

interaction_ids = result.get("metadata", {}).get("interaction_ids", [])

BioGRID 化学相互作用

BioGRID_get_chemical_interactions 始终会包含一条限制说明——化学相互作用的覆盖范围可能不完整。如果未提供生物体，则默认使用 taxId=9606（人类）。

IntAct 的 protein_name 别名

除原始标识符参数外，IntAct 工具还接受 protein_name 作为别名参数。

通过 EBI Proteins-Gateway 访问 IntAct

EBIProteins_get_interactions(accession, limit=50) 和 EBIProteins_get_interaction_details(accession) 是访问上述同一 IntAct 来源相互作用数据的第二种具体途径（通过 EBI Proteins API，而非 IntAct 自身的端点）。当直接输入 UniProt 登录号并获取排序后的互作伙伴，比先通过 STRING/IntAct 映射标识符更方便时，可使用这些工具。

工具	返回内容
EBIProteins_get_interactions	按支持实验数量排序的二元相互作用伙伴；每个伙伴包含 partner_accession、gene_name、experiments（数量）和 organism_differ（布尔值）
EBIProteins_get_interaction_details	一次调用即可返回查询蛋白自身的记录（名称、存在证据、生物体、疾病关联、亚细胞定位）及其主要相互作用伙伴——当你需要在单次请求中获取蛋白质背景信息及其网络，而非分两次获取时，此工具很有用

真实示例（已实时验证）：EBIProteins_get_interactions(accession="P04637")（TP53）→ 198 个伙伴，包括 MDM2（Q00987）、ABL1、AIMP2（6 个实验）、EP300（8 个实验）。EBIProteins_get_interaction_details(accession="P04637") → 在同一响应中返回相同的相互作用数据，以及真实的疾病关联（例如 Li-Fraumeni 综合征）和亚细胞定位；如果额外需要的只是疾病/定位背景信息，可跳过上文单独调用的 UniProt_get_function_by_accession。

领域推理：多聚体组装与结合价数

查证，不要猜测：寡聚状态、亚基化学计量和结合价数。使用 RCSB PDB（RCSBAdvSearch_search_structures、RCSBData_get_entry）或 UniProt（UniProt_get_function_by_accession）确认蛋白质是单体、二聚体、三聚体等。不要仅凭基因名称推断。

根据结合数据计算多聚体价数

价数 = 多聚体复合物上的独立结合位点数量。每个亚基各有一个结合位点的同源二聚体，价数为 2。每个五聚体（例如 IgM）有 2 个 Fab 臂，其价数为 10。

关键推理步骤：

1. 确定寡聚状态：查找 PDB/UniProt 中的四级结构。在溶液中称为“二聚体”的结构，晶体学上可能是二聚体的二聚体（四聚体）。
2. 统计每个亚基的结合位点：除非结合位点跨越界面（此时复合物本身才是功能单元），否则每个亚基都会独立贡献结合位点。
3. 价数 = 亚基数 × 每个亚基的位点数（仅适用于位点相互独立的情况）。如果一个位点上的结合会影响另一个位点，则属于协同性，而非简单的价数。
4. 亲合力与亲和力：多价复合物的结合力强于单个位点（亲合力效应）。表观 Kd_multivalent << Kd_monovalent。增强程度取决于连接臂的柔性和靶标几何结构。

多聚体结合中的统计因子

对称多聚体与配体结合时，统计因子会影响表观速率常数：

• 第一个配体结合：kon_apparent = n x kon_intrinsic（有 n 个等效位点可用）
• 第一个配体解离：koff_apparent = koff_intrinsic（只有一个配体可以解离）
• 一般规律：对于具有 n 个相同位点的多聚体，与第 i 个位点结合时，正向统计因子为 (n - i + 1)，反向统计因子为 i。
• 宏观 Kd 与微观 Kd：Kd_macro(第一个位点) = Kd_micro / n。Kd_macro(最后一个位点) = n x Kd_micro。对于非协同结合，Kd_last / Kd_first = n^2。

如果测得的 Kd 值偏离这些统计预测，则该蛋白表现出正协同性（Kd 的下降幅度超出预期）或负协同性（Kd 的上升幅度超出预期）。

何时使用结合曲线分析，何时使用化学计量分析

方法	适用情况	可提供的信息
化学计量（ITC、AUC、SEC-MALS）	需要了解每个复合物中的结合伙伴数量	n（位点数），而非亲和力
结合曲线（SPR、FP、ELISA）	需要了解 Kd 和动力学	亲和力，但表观 Kd 混合了价态和协同性的影响
Hill 图（双对数结合曲线）	怀疑存在协同性	Hill 系数 nH：nH=1 表示非协同，nH>1 表示正协同，nH<1 表示负协同
Scatchard 图（结合量/游离量对结合量）	经典方法，如今较少使用	曲线 = 多种位点类别或协同性；直线 = 单一 Kd

必需型与兼性多聚体：必需型二聚体（例如许多激酶）没有单体活性。如果你的“纯化蛋白”没有活性，请检查是否需要形成二聚体。使用 SEC 或 native PAGE 确认寡聚状态。低蛋白浓度、高盐或 pH 不合适都可能使必需型多聚体解离。

领域推理：预测卷曲螺旋的寡聚状态

• 七肽重复：(abcdefg)n，其中 a 和 d 位点为疏水核心残基。
• 根据堆积方式判断寡聚状态：二聚体（亮氨酸拉链，d 位点为 Leu）、三聚体（a 位点为 Ile/Val，d 位点为 Leu）、四聚体（a 和 d 位点均为 Leu）、五聚体（复杂的混合堆积，例如 a 位点为 Trp 或极性残基）。
• 七肽重复净图：将残基映射到螺旋轮上；a+d 位点构成疏水核心界面。a/d 位点的残基种类决定堆积几何形态，进而决定寡聚状态。
• a/d 位点的极性残基（Asn、Gln）可决定平行或反平行取向，并选择特定的寡聚状态。
• 查找资料：在 PubMed 中搜索“[sequence motif] coiled coil oligomeric state”，并在仅根据序列预测寡聚状态之前，查询 CC+ 或 SOCKET 数据库。

领域推理：去污剂对膜蛋白的影响

• 温和去污剂（DDM、LMNG、CHAPS、digitonin）可保留天然寡聚状态和脂质相互作用；结构研究首选此类去污剂。
• 强去污剂（SDS、浓度高于 CMC 的 OG）可能使天然复合物解离，并去除具有稳定作用的脂质。
• 在不同去污剂条件下进行原生质谱，可揭示特定脂质是否能稳定寡聚组装体；比较 CHAPS 与 OG 的结果可区分去污剂稳定型与脂质依赖型寡聚体。

蛋白质识别问题

对于“X 是什么蛋白质”这类问题：务必先搜索 UniProt 和 PubMed——不要凭记忆猜测。需要了解的关键通路：

• 淀粉样蛋白清除：基质金属蛋白酶降解胶原蛋白是暴露淀粉样蛋白沉积物的必要条件，从而使巨噬细胞能够吞噬它们。答案是胶原蛋白，而不是血清淀粉样蛋白 P（SAP）或其他淀粉样蛋白结合蛋白。
• 当问题询问“什么蛋白质”时，只给出蛋白质名称——不要附加缩写、描述或限定语。

故障排除

• 未找到相互作用：检查蛋白质名称（区分大小写），尝试使用 confidence_score=0.4
• BioGRID 无法正常工作：在环境中设置 BIOGRID_API_KEY；STRING 无需密钥即可使用
• 输出过于冗长：使用 2>&1 | grep -v "Error loading tools" 进行筛选（请参阅 KNOWN_ISSUES.md）

参考资料

• STRING：https://string-db.org/
• BioGRID：https://thebiogrid.org/（免费注册以获取 API 密钥）
• SASBDB：https://www.sasbdb.org/
• Complex Portal：https://www.ebi.ac.uk/complexportal/
• ToolUniverse：https://github.com/mims-harvard/ToolUniverse