tooluniverse-proteomics-analysis

蛋白质组学分析

规则零 — 首先检查预计算结果

在执行以下任何指令之前，请先扫描数据文件夹，查找：

• *_executed.ipynb → 使用 tu run read_executed_notebook '{"data_folder":"<path>","search":"<keyword>"}' 读取，并将其单元格输出作为权威答案引用
• 预计算结果文件（名称类似 *results*、*deseq*、*enrich*、*stats*、*_simplified.csv 的 CSV/TSV 文件）→ 直接读取并报告所请求的值
• 标准分析脚本（analysis.R、run_*.py、find_*.R、*.Rmd）→ 按原样执行并读取输出

只有当上述内容均不存在时，才按照以下技能中的重新分析步骤操作。重新运行原始数据会得到与已发布答案不同的数字，而且速度慢得多（通常需要多出 5–10 倍的轮次）。

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全面分析基于质谱的蛋白质组学数据，涵盖从蛋白质鉴定到定量、差异表达、翻译后修饰及系统层面的解读。

何时使用此技能

触发条件：用户拥有蛋白质组学质谱输出文件，询问蛋白质丰度/表达、蛋白质差异表达、翻译后修饰分析、蛋白质-RNA 相关性、涉及蛋白质组学的多组学整合、蛋白质复合物/相互作用分析，或蛋白质组学生物标志物发现。

计算，不要只描述

如果分析需要计算（统计、数据处理、评分、富集分析），请通过 Bash 编写并运行 Python 代码。不要只描述你会怎么做——请实际执行并报告结果。使用 ToolUniverse 工具获取数据，然后使用 Python（pandas、scipy、statsmodels、matplotlib）进行分析。

核心能力

• 数据导入：MaxQuant、Spectronaut、DIA-NN、Proteome Discoverer、FragPipe 输出
• 质量控制：缺失值分析、强度分布、样本聚类
• 归一化：中位数、分位数、TMM、VSN——具体选择取决于实验设计（参见“解读框架”）
• 插补：对缺失值使用 MinProb（MNAR）、KNN（MAR）、QRILC
• 差异表达：使用 Limma、DEP、MSstats 进行统计检验
• 翻译后修饰分析：磷酸化位点定位、翻译后修饰富集分析、激酶预测
• 蛋白质-RNA 整合：相关性分析、翻译效率
• 通路富集：对蛋白质集合进行过度代表分析和 GSEA
• PPI 分析：通过 STRING/IntAct 进行蛋白质复合物检测和相互作用网络分析

工作流概览

Input: MS Proteomics Data
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Phase 1: Data Import & QC
Phase 2: Preprocessing (filter, impute, normalize)
Phase 3: Differential Expression Analysis
Phase 4: PTM Analysis (if applicable)
Phase 5: Functional Enrichment (GO, KEGG, Reactome)
Phase 6: Protein-Protein Interactions (STRING networks)
Phase 7: Multi-Omics Integration (optional, protein-RNA correlation)
Phase 8: Generate Report

各阶段的详细流程请参见 PHASE_DETAILS.md。

与 ToolUniverse 集成

技能	用途	阶段
tooluniverse-gene-enrichment	通路富集	阶段 5
tooluniverse-protein-interactions	PPI 网络	阶段 6
tooluniverse-rnaseq-deseq2	用于整合的 RNA-seq	阶段 7
tooluniverse-multi-omics-integration	跨组学分析	阶段 7
tooluniverse-target-research	蛋白质注释	阶段 8
tooluniverse-proteomics-data-retrieval	查找公开的癌症蛋白质组学研究/定量矩阵（PDC/CPTAC），以便重新分析	阶段 1（输入）

正常组织表达背景（ProteomicsDB）

src/tooluniverse/data/proteomicsdb_tools.json 提供 5 个工具，用于分析正常人体组织、细胞系和体液中的 MS 蛋白表达——在 Phase 8（报告/解读）中，可用于为 DE 结果提供背景信息：某种蛋白是否通常只在特定组织中表达（那么 DE 命中在生物学上更值得关注），还是普遍表达（那么 DE 命中的特异性较低）？可与基于抗体的 HPA 表达数据及 PDC 的癌症队列定量数据（tooluniverse-proteomics-data-retrieval）互为补充。

工具	用途
ProteomicsDB_search_proteins	首先将基因符号/名称解析为正确的 UniProt 登录号——宽泛的查询（例如 "EGFR"）可能返回名称/基因恰好包含该子字符串的无关蛋白（已通过实时查询验证：搜索 "EGFR" 时，除真正的 EGFR 亚型外还返回了 FLT1）；使用命中项的 uniprot_id 前，务必检查每项的 gene_name
ProteomicsDB_get_protein_expression	获取 UniProt 登录号对应的完整逐组织表达记录——expression_value（经 log10 归一化，可跨组织比较）与 unnormalized_intensity（不可跨组织比较；切勿根据此字段排序）
ProteomicsDB_get_expression_summary	按表达量排序的前 N 个组织/细胞系，以及组织/细胞系/体液总数——只想知道“这种蛋白在哪些组织中表达量最高”时的快捷方式（已通过实时查询验证：EGFR 表达量最高的项目全是乳腺癌/食管癌细胞系，而非正常组织——对于许多癌基因，细胞系在 ProteomicsDB 的数据覆盖中占主导，因此如果需要正常组织基线，请检查 tissue_category）
ProteomicsDB_list_tissues	列出所有组织/细胞系/体液及其 BTO 本体 ID，以便筛选前查看
ProteomicsDB_get_peptides_for_protein	肽段层面的鉴定证据（序列、唯一性、q 值、来源实验/PubMed ID）——提供组织表达工具不具备的鉴定层面支持

响应封装：所有工具成功时均返回 {"status": "success", "data": {...}}。除非已有确认无误的 UniProt 登录号，否则请先使用 ProteomicsDB_search_proteins，再使用 ProteomicsDB_get_protein_expression/_get_expression_summary/_get_peptides_for_protein。

定量最低要求

• 至少定量 500 种蛋白（人类样本：3,000+ 种较为合理；10,000+ 种属于深度覆盖）
• 每种条件至少 3 个生物学重复（可靠统计的硬性要求）
• 筛选具有 2 条以上唯一肽段的蛋白（单肽段 ID 不报告为 DE）
• 统计检验：使用 limma 或 t 检验，并进行 Benjamini-Hochberg 多重检验校正
• 通路富集：至少采用一种方法（GO、KEGG 或 Reactome）
• 报告必须包含：QC 摘要、带火山图的 DE 结果、通路分析、可视化

解读框架

起点：实验设计

定量蛋白质组学比较蛋白质丰度。查证，不要猜测——选择分析策略前，务必核实实验方法、平台和重复数。

定量策略决策树：

• 细胞培养，且需要高准确度 → SILAC（同一 MS 运行内比较比值，准确度最高，但仅适用于培养样本）
• 多种条件，且需要多重检测 → TMT/iTRAQ（单次运行最多可进行 18-plex；采用 TMM/VSN 归一化；注意比值压缩伪影会降低观测到的倍数变化）
• 探索性研究，设计灵活 → 非标记定量（LFQ）（基于强度；采用中位数/分位数归一化；缺失值更多；动态范围更宽）
• 重复数：n < 3 时，倍数变化不可靠（无法估计方差）。生物学重复至少 n = 3；临床样本优选 n >= 4。切勿报告基于重复测量的显著性。
• FDR 截止值：必须进行 Benjamini-Hochberg 校正。FDR < 0.05 为标准；FDR < 0.01 要求严格。切勿只报告未经校正的 p 值。

蛋白质鉴定推理

基于 MS 数据鉴定蛋白质遵循一条逻辑链。查证而非猜测——搜索 UniProt 和 STRING 获取蛋白质注释，而不是仅凭名称推断功能。

1. 肽质量指纹图谱（PMF）：完整蛋白质经消化后，将测得的肽段质量与数据库中所有蛋白质的理论消化结果进行比较。匹配至少需要 ≥4 条肽段，覆盖蛋白质序列的 ≥15%。单肽段命中不可靠（可能匹配多个蛋白质）。
2. 串联 MS（MS/MS）：使用搜索引擎（Andromeda、SEQUEST、X!Tandem）将碎片离子谱与肽段序列匹配。对每个肽段-谱图匹配（PSM）进行评分；只有高于 FDR 阈值的 PSM 才计入。唯一肽段（仅映射到一种蛋白质）至关重要——共享肽段无法区分不同的蛋白质亚型。
3. 蛋白质推断：多条肽段 → 蛋白质组。当肽段在同源蛋白质之间共享时，应报告蛋白质组（而非单个蛋白质）。使用 proteins_api_search 或 UniProt_search 解析有歧义的蛋白质组。
4. 覆盖度很重要：至少需要 2 条唯一肽段，才能自信地鉴定蛋白质。仅凭一条唯一肽段鉴定出的蛋白质应标记为暂定结果。

翻译后修饰（PTM）分析推理

PTM（磷酸化、泛素化、乙酰化、糖基化）会在蛋白质丰度之外增加生物学复杂性。

1. 位点定位：只有当定位概率 > 0.75（MaxQuant）或 ptmRS 评分 > 75（Proteome Discoverer）时，才能确信磷酸化位点已被定位。对于有歧义的位点，不应报告为特定残基修饰。
2. 必须进行富集：如果未进行磷酸化富集（TiO2、IMAC），只能检测到丰度最高的磷酸化肽段（约占磷酸化蛋白质组的 1%）。在未富集数据中未发现磷酸化位点，并不意味着该位点在生物学上不存在。
3. 激酶预测：如果鉴定出磷酸化位点，应通过基序分析预测上游激酶。交叉参考 OpenTargets_get_target_safety_profile_by_ensemblID，了解激酶与疾病的关联。应在 PhosphoSitePlus 中查证激酶-底物关系，而不是仅凭序列基序猜测。
4. 化学计量比：某个蛋白质在特定位点的磷酸化比例可能是 5% 或 95%——这对功能影响极大，但很难测量。应报告数据是否支持化学计量比估算，还是只能鉴定位点。

差异表达阈值

• 强：padj < 0.01，FC > 2.0，≥5 条唯一肽段，缺失率 <20%
• 中等：padj 0.01-0.05，FC 1.5-2.0，2-5 条肽段，缺失率 20-50%
• 弱/不可靠：padj 0.05-0.1，FC 1.2-1.5，1-2 条肽段（单肽段蛋白质不可靠），缺失率 >50%（需要进行插补）

证据分级

• T1：经正交方法（Western blot、PRM）验证 + 功能研究
• T2：在 ≥2 个生物学重复中差异显著（padj < 0.05，FC > 1.5）
• T3：在 1 项实验中差异显著，或差异显著但 FC 较低
• T4：已鉴定但未定量，或仅通过单条肽段鉴定

综合分析问题

1. 有多少种蛋白质存在差异表达？（>500 种 DE 蛋白质提示整体扰动；<50 种提示靶向效应）
2. 关键通路蛋白质的调控方向是否一致？（复合物的所有亚基都发生变化 = 高置信度）
3. 蛋白质组学结果是否与转录组学相关？（相关性较低很常见——可能存在翻译后调控）
4. PTM 变化是否驱动了表型？（如果有磷酸化蛋白质组学数据，请进行检查）
5. 相对于预期蛋白质组的覆盖度如何？（人类：定量约 10K 种蛋白质为良好；<3K 则较有限）

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局限性

• 平台特定：针对基于 MS 的蛋白质组学进行了优化（不适用于 Western blot 定量）
• 缺失值：缺失率较高（每种蛋白质超过 50%）会降低统计效能
• PTM 分析：全面分析 PTM 需要富集方案
• 绝对定量：仅能测量相对丰度（除非使用 TMT/SILAC）
• 蛋白质异构体：通常会合并到基因水平
• 动态范围：与 mRNA 测序相比，MS 的动态范围有限

参考资料

方法：MaxQuant (doi:10.1038/nbt.1511)、蛋白质组学的 Limma (doi:10.1093/nar/gkv007)、DEP 工作流 (doi:10.1038/nprot.2018.107)

数据库：STRING、PhosphoSitePlus、CORUM

参考文件

• PHASE_DETAILS.md - 各分析阶段的详细流程，包括报告模板